肉瘤組織中COL6A1基因的表達水平及其意義

胡偉全 趙琴飛 朱龍玉 胡素萍 陳芳芳

(1 贛州市人民醫院關節外科,江西 贛州 341000; 2 贛南醫學院第一附屬醫院檢驗科; 3 河北醫科大學第四醫院放療科;4 贛南醫學院第一附屬醫院急診科; 5 東部戰區總醫院檢驗醫學研究所基礎醫學實驗室)

肉瘤是一種間充質來源的異質性惡性腫瘤,比較罕見,約占所有兒童惡性腫瘤的21%,所有成人惡性腫瘤的1%[1]。目前已鑒定出100多種不同的肉瘤實體,大致分為軟組織肉瘤和骨肉瘤[2-3]。目前肉瘤的標準治療方案主要有手術切除、化學療法和放射療法,但近幾年來患者的療效和預后并沒有顯著提高[4]。Ⅵ型膠原A(COL6A)是蛋白質超家族中的一員,由3條主要的多肽鏈(α1、α2和α3)組成,是主要的細胞外基質之一[5]。研究發現,在宮頸癌、前列腺癌、肺癌以及胰腺癌等腫瘤組織中COL6A1基因呈顯著高表達,并且與腫瘤進展密切相關[6-9],但COL6A1基因在肉瘤組織中的表達水平及其作用機制尚未見相關研究報道。本研究旨在通過生物信息學方法分析COL6A1基因在肉瘤發生發展及預后中的作用及其機制,為肉瘤患者的治療提供參考依據?，F將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 GEO數據庫不同類型肉瘤組織中COL6A1～3基因表達水平

在GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)選取并下載骨肉瘤數據集GSE16088[10]、軟組織肉瘤數據集GSE21122[11]和腎透明細胞肉瘤數據集GSE49972[12]的原始測序數據,用R軟件Limma軟件包對數據標準化后,分析骨肉瘤、軟組織肉瘤和腎透明細胞肉瘤組織中COL6A1～3基因表達水平。肉瘤組織和正常組織中差異基因比較用Wilcoxon檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

1.2 肉瘤組織中COL6A1～3基因的表達水平與患者的生存、免疫細胞浸潤的相關性分析

從TCGA數據庫(https://genome-cancer.ucsc.edu/)中下載肉瘤組織以及正常組織樣本的轉錄組RNAseq數據和患者的生存數據。采用R軟件的survival包分析肉瘤組織中COL6A1～3基因的表達水平與患者生存的相關性,并通過survminer包繪制患者的Kaplan-Meier(KM)生存曲線[13],并進行Log-rank檢驗,以P<0.05為差異具有統計學意義。采用GSVA包[14]對肉瘤組織中COL6A1基因的表達水平與24種免疫細胞[15]浸潤之間的相關性進行Spearman相關性分析,以P<0.05為差異具有統計學意義。

1.3 肉瘤組織中與COL6A1共表達基因的分析以及COL6A1和COL6A2基因表達的相關性分析

通過LinkedOmics數據庫(http://www.linkedomics.org/login.php)[16]分析肉瘤組織當中與COL6A1存在相關性的其他差異表達的基因,即COL6A1的共表達基因,分析結果以皮爾遜相關系數表示。通過R軟件的ggstatsplot包對肉瘤組織中COL6A1和COL6A2基因表達的相關性進行Spearman分析,以P<0.05為差異有統計學意義。

1.4 肉瘤組織中COL6A1共表達基因的GO功能富集分析和KEGG通路分析

使用R軟件的clusterProfiler包對與COL6A1共表達基因進行GO功能富集分析和KEGG通路分析[17]。

1.5 肉瘤組織當中COL6A1共表達基因的激酶、miRNA及轉錄因子靶標分析

在分子特征數據庫當中[18]使用GSEA分析COL6A1共表達基因的激酶、miRNA及轉錄因子靶標,等級標準參數即錯誤檢測率(FDR)<0.05,且進行了500次模擬。

2 結 果

2.1 不同類型肉瘤組織中COL6A1～3基因的表達水平

GEO數據庫分析結果顯示,與正常組織相比,骨肉瘤和軟組織肉瘤組織中COL6A1～3基因的表達水平均顯著升高(t=2.68～7.98,P<0.05),腎透明細胞肉瘤組織當中COL6A1以及COL6A2基因的表達水平亦顯著升高(t=2.95、2.80,P<0.05),COL6A3表達水平無顯著差異(P>0.05)。

2.2 肉瘤組織中COL6A1～3基因的表達水平與預后的相關性分析

KM生存曲線分析結果顯示,肉瘤組織當中COL6A1基因表達水平與患者的總體生存率(OS)和疾病特異生存率(DSS)有關(χ2=6.37、4.57,P<0.05),詳見圖1A、B;肉瘤組織當中COL6A2以及COL6A3的高表達與患者的OS和DSS無顯著相關性(P>0.05)。

A、B分別為肉瘤組織中COL6A1基因表達水平與患者的OS、DSS的KM生存曲線

2.3 肉瘤組織中COL6A1基因的表達水平與免疫細胞浸潤的相關性

GSVA包分析結果顯示,肉瘤組織中COL6A1基因的表達水平與中性粒細胞、輔助性T細胞2和成熟樹突狀細胞浸潤存在顯著正相關(r=0.240～0.280,P<0.05)。

2.4 肉瘤組織中與COL6A1共表達基因分析以及COL6A1和COL6A2基因表達的相關性分析

在LinkedOmics數據庫中,分析肉瘤組織當中與COL6A1共表達的基因情況,分析結果顯示,與COL6A1表達水平顯著正相關的基因2 444個,與COL6A1表達水平顯著負相關的基因有3 711個(FDR<0.05),圖2A、B分別顯示了與COL6A1呈現顯著正相關和負相關的前50個基因,其中紅色表示了高表達基因,藍色表示低表達基因。R軟件的ggstatsplot包進一步分析結果顯示,肉瘤組織當中COL6A1和COL6A2的表達呈顯著正相關性(r=0.830,P<0.05)。

a:與COL6A1正相關的前50個基因熱圖,B:與COL6A1負相關的前50個基因熱圖

2.5 肉瘤組織中與COL6A1共表達基因的GO功能富集分析和KEGG通路分析

GO功能富集分析結果顯示,與COL6A1相關的共表達基因主要位于突觸前、神經元細胞體和細胞-基質連接等成分中,主要參與多細胞生物體內平衡、中性粒細胞介導的免疫反應、中性粒細胞參與的活化免疫反應等生物學過程。KEGG通路分析結果顯示,這些基因主要在PI3K-Akt信號通路、人乳頭瘤病毒感染、神經元活性配體-受體相互作用和MAPK信號通路中富集。

2.6 肉瘤組織當中COL6A1共表達基因的激酶、miRNA及轉錄因子靶標分析

肉瘤組織中與COL6A1共表達基因的GSEA分析結果顯示,與COL6A1共表達基因相互作用的5個最重要的激酶靶標是PRKCA、SRC、LYN、PRKAA1和PAK1; 重要的miRNA靶標是miR-506、miR-200B、miR-200C、miR-429和miR-330;重要轉錄因子靶標是V$ETS2_B、V$AP1_C、V$PU1_Q6、V$RORA1_01和V$AP1_Q2。

3 討 論

肉瘤是相對罕見的異質性惡性腫瘤,患者死亡率極高[19],目前的治療方法主要還是手術切除、放療和化療,患者的預后很差[20]。因此迫切需要深入探討肉瘤發病的分子機制,挖掘其有效的預后和治療靶點。

COL6A1是脊椎動物中的保守基因,幾乎存在于機體內的所有結締組織當中,以維持組織的完整性[21]。研究發現,腫瘤組織中COL6A1的高表達與腫瘤進展密切相關[22]。COL6A1還被發現參與多種腫瘤細胞的黏附、侵襲和轉移過程[9,23]。此外,前列腺癌細胞系中COL6A1基因敲減以后會通過JK-STAT途徑抑制前列腺癌細胞的增殖[7]。目前關于COL6A1在肉瘤組織中的表達情況及其作用機制尚不清楚。

本研究首先通過在GEO數據庫的GSE16088、GSE21122和GSE49972數據集中對肉瘤組織和正常組織中的COL6A1～3基因表達進行差異分析,結果顯示,與正常組織相比,COL6A1基因在骨肉瘤、軟組織肉瘤和腎透明細胞肉瘤等組織中的表達水平均顯著升高。進一步KM生存曲線分析顯示,肉瘤組織中COL6A1基因高表達的患者,預后更差。以上結果表明,COL6A1可能在肉瘤的發生發展中具有重要作用。

為進一步了解COL6A1共表達基因在肉瘤中的作用機制,本研究對肉瘤組織中COL6A1共表達基因進行了GO功能富集分析和KEGG通路分析。GO功能富集分析結果顯示,肉瘤組織中COL6A1共表達基因主要參與多細胞生物體內平衡、中性粒細胞介導的免疫反應和中性粒細胞參與的活化免疫反應等生物學過程。免疫細胞浸潤相關性分析同樣表明,肉瘤組織中COL6A1基因的表達水平與中性粒細胞的細胞浸潤水平之間存在顯著相關性。這表明COL6A1表達可能主要通過影響腫瘤微環境中的免疫浸潤,尤其是中性粒細胞的細胞浸潤,進而影響患者的預后和生存。在過去的幾年中,越來越多的證據表明免疫系統在腫瘤的控制和進展中起著重要作用[24]。免疫療法在某些類型的腫瘤,例如非小細胞肺癌以及黑素瘤的治療當中獲得了喜人的結果[25],本研究結果可能對肉瘤的免疫治療具有一定的意義。此外,本研究KEGG通路分析顯示,肉瘤組織中COL6A1共表達基因主要富集于PI3K-Akt信號通路、人乳頭瘤病毒感染、神經元活性配體-受體相互作用以及MAPK信號通路中,因此這些基因表達水平的變化可能與肉瘤的發生發展具有重要的關系。

本研究通過GSEA分析肉瘤組織中COL6A1共表達基因的重要激酶、miRNA及轉錄因子靶標,以進一步揭示COL6A1在肉瘤中的作用機制。本研究結果顯示,與COL6A1共表達基因相互作用的5個最重要的激酶靶標是PRKCA、SRC、LYN、PRKAA1、和PAK1;重要的miRNA靶標是miR-506、miR-200B、miR-200C、miR-429和miR-330;重要轉錄因子靶標是V$ETS2_B、V$AP1_C、V$PU1_Q6、V$RORA1_01和V$AP1_Q2。然而這些激酶、miRNA及轉錄因子調控機制比較復雜,需要進一步實驗驗證,以期為臨床治療提供重要指導。雖然LinkedOmics數據庫的共表達分析以及R軟件ggstatsplot包的相關性分析均表明COL6A1和COL6A2之間呈顯著正相關,COL6A家族成員之間的相互作用及其具體的分子機制也仍有待進一步研究。

綜上所述,本研究通過對多個數據庫當中肉瘤患者的RNA測序數據進行生物信息學分析提示,COL6A1基因在肉瘤組織中顯著高表達,COL6A1基因的高表達也與肉瘤患者的不良預后密切相關,COL6A1可能是肉瘤的一個有價值的預后指標和潛在的治療靶點。本研究可為肉瘤患者的預后及治療提供新的思路和理論依據。

作者聲明：胡偉全、趙琴飛、陳芳芳參與了研究設計;胡偉全、趙琴飛、朱龍玉、胡素萍、陳芳芳參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文,且均聲明不存在利益沖突。