高強度阿托伐他汀致肝損傷小鼠腸道菌群的改變及其與肝臟CYP2E1的關系

宋冰雪 宋雨晴 劉鑫 于海初 辛輝 梁惠

(1 青島大學附屬醫院心血管內科,山東 青島 266100; 2 青島大學醫學部; 3 青島大學公共衛生學院)

目前臨床對于動脈粥樣硬化斑塊不穩定患者普遍采用高強度他汀類藥物治療[1-3]。研究發現,高強度阿托伐他汀(ATO,40～80 mg/d)可使低密度脂蛋白膽固醇(LDL-H)降低幅度>50%,但強度增加的同時,不良反應發生率也隨之增加,如肝損傷、胃腸道反應等[4-6]。細胞色素P450酶超家族(CYP)參與的氧化應激損傷是目前公認的他汀類藥物致肝損傷機制之一。CYP2E1屬于肝臟CYP之一,不僅參與藥物或外源性物質轉化,同時也參與了氧化應激反應激活和調節,是氧自由基產生的關鍵酶[7-8]。CYP2E1基因的過度表達能夠降低抗氧化酶水平,增加氧化應激損傷,介導炎癥反應的發生[9-10]。

人體腸道存在大量正常菌群,當機體內外環境變化時,比如受藥物、疾病等影響,腸道內各菌種間的比例可發生改變,即引起菌群失調[11-12]。在不同肝損傷模型中均發現有腸道菌群失調以及肝組織中CYP2E1表達增加的現象[13]。目前,他汀類藥物致肝損傷與腸道菌群穩態失調及CYP2E1表達水平的相關性仍不明確。本研究旨在探討高強度他汀類藥物致肝損傷后,對腸道菌群分布的影響及其與肝臟中CYP2E1水平的關系。

1 材料與方法

1.1 材料來源

C57BL/6小鼠40只,體質量21～24 g,由青島大學無特定病原體動物實驗室提供。隨機分為對照組(CON組)、低強度ATO組(ATO-L組)、中強度ATO組(ATO-M組)、高強度ATO組(ATO-H組),每組10只。

1.2 各組小鼠的處理

ATO-L組、ATO-M組和ATO-H組小鼠每天清晨分別灌胃含有10、20、30 mg/kg ATO的生理鹽水1 mL,CON組小鼠每天灌胃等量生理鹽水,持續4周。于末次灌胃后,收集每組小鼠新鮮糞便;同時每組小鼠禁食不禁水12 h,腹腔麻醉后,眼眶取血,分離血清;并迅速解剖分離出肝臟,用生理鹽水漂洗,濾紙拭干后備用。

1.3 肝臟形態學評估

1.3.1肝組織病理學觀察 切取各組小鼠肝大葉相同部位約0.9 cm×0.9 cm×0.5 cm大小的組織塊,置于40 g/L的多聚甲醛溶液中固定24 h后脫水,二甲苯透明30 min以后,常規石蠟包埋,以4～5 μm厚度連續切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,梯度乙醇脫水,二甲苯透明后,中性樹脂封片。顯微鏡下進行病理學觀察并拍照。

1.3.2肝組織超微結構觀察 再次切取各組小鼠肝大葉相同部位約3 mm×1 mm×1 mm的組織塊,置于4 ℃的0.28 mol/L戊二醛溶液中固定24 h后,用0.10 mol/L磷酸緩沖液漂洗,0.03 mol/L鋨酸固定,梯度丙酮脫水,環氧樹脂(EPON812)包埋,采用超薄切片機50～70 nm厚切片,經醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛各染色15 min后,透射電鏡下進行超微結構觀察并拍照。

1.4 血清及肝臟組織中各項指標檢測

采用雙抗體夾心法檢測每組小鼠血清中谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)水平;采用酶聯免疫吸附試驗檢測每組小鼠血清中IL-6、IL-10以及TNF-α水平;采用黃嘌呤氧化酶法檢測每組小鼠肝臟組織中SOD活力;采用實時定量PCR方法檢測各組小鼠肝臟組織中CYP2E1 mRNA的相對表達水平。以上所有的操作步驟均嚴格按照說明書的要求進行。

1.5 腸道菌群的測定

取ATO-H組與CON組小鼠新鮮糞便,委托山東銳翌基因科技有限公司提取糞便樣品中基因組DNA并質檢,采用16SrDNA測序法分析糞便中腸道菌群的分布。采用運算分類單位分析、物種分類與豐度分析、顯著性差異分析等方法,比較優勢菌株在門、科、屬分類等級的豐度及差異。

2 結 果

2.1 各組小鼠肝臟形態學比較

HE染色顯示,CON組小鼠肝小葉結構清楚,細胞排列整齊,胞漿均勻,肝細胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列;ATO-L組小鼠肝小葉結構基本正常,中央靜脈有少量紅細胞聚集,肝索排列較為整齊;ATO-M組小鼠肝小葉結構紊亂,中央靜脈有紅細胞聚集,肝索排列不齊,肝竇擴張,中央靜脈和匯管區見炎性細胞浸潤,空泡數量增多;ATO-H組小鼠肝小葉結構模糊,中央靜脈充滿紅細胞和液體滲出物,肝細胞腫脹、排列紊亂,細胞核變形,擴張的充血性竇壓迫周圍肝細胞板,中央靜脈和匯管區可見大量炎性細胞浸潤,并且可見空泡化的細胞質和凋亡細胞。

透射電鏡觀察結果顯示,CON組肝細胞核呈規則圓形或橢圓形,染色質分布較細,核膜完整清晰,線粒體形態正常,嵴結構清晰,粗面內質網扁平、排列整齊,細胞邊界中有毛細膽管和緊密連接,偶見溶酶體和脂滴;ATO-L組胞質脂滴、溶酶體數量較CON組增多;ATO-M組細胞核形態基本正常,細胞膜欠清,線粒體大小不一,數目較ATO-L組增多,粗面內質網腫脹、排列紊亂,溶酶體、脂滴數量較ATO-L組增多;ATO-H組細胞核出現萎縮、變形,形狀不規則,染色質濃縮,核膜不規則、模糊,細胞膜界限不清,線粒體數量較ATO-M組明顯增多,形態不一,嵴結構模糊,粗面內質網腫脹擴張斷裂,排列紊亂無序,脂肪滴較ATO-M組增多,溶酶體減小,數目增多,糖原顆粒增多。

2.2 各組小鼠血清及肝組織中各項指標的比較

各組小鼠血清中ALT、AST、IL-6、TNF-α和肝組織中SOD活力比較差異均有顯著性(F=4.57～7.74,P<0.05),其中ATO-H組小鼠血清中ALT、AST水平與CON組、ATO-L組及ATO-M組比較差異均有顯著性(P<0.05),ATO-M組小鼠血清中AST水平與CON組比較均差異有顯著性(P<0.05);CON組小鼠血清中IL-6水平與ATO-L組、ATO-M組以及ATO-H組比較差異均有顯著性(P<0.05);ATO-H組小鼠血清中TNF-α水平與CON組、ATO-L組比較差異有顯著性(P<0.05);CON組小鼠的肝組織中SOD活力與ATO-L組、ATO-M組及ATO-H組比較差異均具有顯著意義(P<0.05);各組小鼠血清中IL-10水平和肝組織中CYP2E1 mRNA表達水平比較差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血清及肝組織中各項指標比較

表2 CON組與ATO-H組小鼠腸道菌群優勢物種在門水平的相對豐度比較

2.3 高強度ATO干預對小鼠腸道菌群分子生態學的影響

在門水平,與CON組比較,ATO-H組擬桿菌門的相對豐度顯著降低(t=2.89,P<0.05),而厚壁菌門、變形菌門和脫鐵桿菌門相對豐度則顯著升高(t=3.30～5.22,P<0.05),見表2。ATO-H組與CON組厚壁菌門/擬桿菌門(F/B)豐度比值分別為0.73±0.09和0.27±0.16,兩組比較差異有顯著性(t=5.56,P<0.05)。在科水平,與CON組比較,ATO-H組毛螺菌科、紫單孢菌科、普氏菌科和乳桿菌科相對豐度顯著降低(t=2.45～5.33,P<0.05),螺桿菌科的相對豐度顯著升高(t=5.46,P<0.05)。見表3。在屬水平,與CON組比較,ATO-H組小鼠腸道菌群優勢物種螺桿菌屬相對豐度顯著性升高(t=7.41,P<0.05),擬普雷沃菌屬、普氏菌屬和乳桿菌屬相對豐度則明顯減低(t=2.46～3.20,P<0.05)。見表4。

表3 CON組與ATO-H組小鼠腸道菌群優勢物種在科水平的相對豐度比較

表4 CON組與ATO-H組小鼠腸道菌群優勢物種在屬水平的相對豐度比較

2.4 腸道菌群與肝組織SOD活力和CYP2E1水平的相關性分析

將上述在屬水平相對豐度差異有顯著性的螺桿菌屬、擬普雷沃菌屬、普氏菌屬和乳桿菌屬與肝組織SOD活力及CYP2E1 mRNA表達行相關性分析結果顯示,乳桿菌屬相對豐度與肝組織SOD活力呈顯著正相關(r=0.48,P<0.05),與肝組織CYP2E1 mRNA表達呈負相關(r=-0.62,P<0.05)。

3 討 論

他汀類藥物相關的肝損傷是臨床上十分關注的不良反應之一[14-15]。目前,全球應用他汀類藥物的人群廣泛,高強度ATO的應用會增加肝損傷的發生率[6]。本研究結果顯示,中強度及高強度的ATO可導致顯著的肝損傷,ATO-M組、ATO-H組小鼠肝臟組織HE染色及肝臟組織透射電鏡下的超微結構均提示有明顯的改變,血清ALT、AST水平升高顯著,炎癥反應被激活,肝組織SOD活力下降,提示中高強度他汀類藥物可導致小鼠肝損傷,引起了小鼠抗氧化酶活力下降。本研究結果還顯示,肝損傷嚴重的ATO-H組小鼠肝組織中CYP2E1 mRNA表達水平有升高趨勢,與其他研究結果一致。如MOTAWI等[16]發現他汀類藥物導致的大鼠肝臟損傷模型中,肝臟CYP2E1活性顯著升高,而通過柚皮素抑制肝臟CYP2E1的上調可以發揮肝保護作用;REN等[17]發現CYP2E1特異性抑制劑(二烯丙基硫化物)可以抵消氧化應激損傷、細胞內Ca2+穩態失調及細胞凋亡等。另外,多酚類物質(丁香苷)、大蒜素及生物堿提取物等天然成分對肝臟的保護作用,其機制均是抑制肝臟CYP2E1的表達和抗氧化的作用[18]。所以,CYP2E1的表達水平升高,可能是他汀類藥物致肝損傷的重要機制。

本研究進一步對高強度ATO干預后小鼠腸道菌群分布進行分析,結果顯示ATO-H組小鼠腸道菌群穩態失調,菌群相對豐度顯著改變,ATO-H組和CON組小鼠腸道菌群F/B差異有顯著性。由于厚壁菌門囊括了幾乎所有革蘭陽性菌(G+),而擬桿菌門包含了大部分革蘭陰性菌(G-),因此上述結果提示他汀類藥物干預后腸道中G+與G-構成比發生改變,使腸道菌群紊亂、穩態失衡。ATO-H組小鼠腸道菌群中乳桿菌屬相對豐度明顯下降。進一步對乳桿菌屬與肝組織中CYP2E1 mRNA的表達水平進行相關性分析,結果顯示,小鼠腸道中乳桿菌屬與肝組織中CYP2E1 mRNA表達水平呈顯著負相關,與肝組織SOD活力呈顯著正相關,提示當高強度他汀類藥物干預以后,腸道菌群乳桿菌屬占比下降,CYP2E1 mRNA表達水平升高,肝組織SOD活力隨之下降。由此可以推測,肝臟損傷小鼠的腸道存在菌群穩態失調,腸道中乳桿菌屬的占比與肝組織中CYP2E1 mRNA表達水平密切相關。

本研究分析了高強度ATO肝損傷小鼠的腸道菌群組成,與CON組相比,ATO-H組優勢菌群及菌群的相對豐度具有明顯的差異,提示他汀類藥物干預后小鼠腸道菌群豐度及多樣性可能受到顯著影響,菌群穩態失衡與肝臟損傷之間可能存在相互促進的關系。有研究發現,腸道菌群的改變在肝損傷的進展中起著重要的作用,肝臟通過門脈系統和膽道系統與腸道菌群密切關聯,肝功能異常時,會削弱腸道的屏障功能,引起腸道菌群的穩態失衡,而菌群失衡可能會促使肝臟氧化應激及炎性反應的激活,導致肝細胞損傷和凋亡[19-20]。同時,本研究發現他汀類藥物干預后腸道菌群乳桿菌屬的相對豐度與肝組織SOD水平及CYP2E1 mRNA表達水平均具有顯著相關性。目前,已有研究發現肝臟組織中CYP2E1的表達水平,受機體腸道菌群穩態的影響。JOUROV等[21]通過比較正常小鼠和無菌小鼠的腸道菌群分布,提出腸道菌群影響肝組織中CYP2E1的表達水平。ZHANG等[22]在四氯化碳誘導的肝損傷模型中發現肝組織SOD表達水平下降,CYP2E1表達水平增加,激活了機體氧化應激反應,給予補充羊奶,即改善腸道菌群分布后,腸道菌群失衡得到改善,且CYP2E1的表達下調。CHO等[23]在對乙酰氨基酚誘導肝損傷模型中證實腸道菌群穩態與肝組織中CYP2E1表達及SOD活力密切相關,且改善腸道菌群穩態可以調節CYP2E1的表達以及SOD的活力。此外,乳桿菌屬作為一種重要的腸道益生菌,參與腸道中糖、蛋白質等物質代謝及乳酸、丁酸等短鏈脂肪酸的產生,并對維護腸道微生態穩定發揮重要調節作用[24-25]。

綜上所述,本研究結果顯示,高強度他汀類藥物致肝損傷后可能通過影響腸道菌群穩態,使肝組織中CYP2E1的表達水平上調,激活氧化應激,降低抗氧化酶的水平,從而導致肝損傷的發生,其中,腸道菌群乳桿菌屬的減少可能促進肝臟氧化應激。但具體機制均需進一步驗證。

倫理批準和動物權利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學附屬醫院醫學倫理委員會的審核批準(文件號QYFYWZLL-27294)。所有實驗過程均遵照動物實驗的“3R”原則及《關于善待實驗動物的指導性意見》的條例進行。

作者聲明：宋冰雪、辛輝、梁惠參與了研究設計;宋冰雪、宋雨晴、劉鑫、于海初參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文,且均聲明不存在利益沖突。