一種提升阿卡波糖發酵水平的補料控制方法

俞曉蕓,李 娜,高雙玉

(杭州中美華東制藥有限公司,浙江 杭州 310011)

作為一種微生物發酵產品,阿卡波糖是游動放線菌(Actinoplanessp.)發酵產生的C7N-氨基環醇類的假性四糖物質,因其可與α-葡萄糖苷酶發生競爭性抑制作用而被廣泛應用于2型糖尿病的治療,能有效降低糖尿病患者的餐后血糖[1-3]。

隨著醫藥市場新政策的實施,產品的技術水平提升和生產成本降低是提高產品市場競爭力的重要因素。在工業化生產中,微生物發酵產阿卡波糖存在周期較長、水平較低的問題。在發酵中后期,菌體的衰老使得產物合成速率降低已成為阿卡波糖發酵生產中需要解決的一個重要問題。在發酵中采用合適的補料工藝可以有效提高菌種的生產能力,分批補料發酵的關鍵是對補料控制方法的優化[4-5]。筆者的研究目的是根據菌種的特性,調整發酵過程中的補料工藝控制參數,以提高其發酵水平。碳源和氮源是微生物生長代謝的主要原料,根據阿卡波糖的生物合成途徑,葡萄糖和麥芽糖作為合成原料直接參與阿卡波糖的合成,在控制葡萄糖質量分數的同時維持麥芽糖質量分數在適當的水平可促進阿卡波糖的合成[6-10]。陳學軍等[8]在發酵培養基和補料培養基中選用麥芽糖和葡萄糖,且當其配比為m(麥芽糖)∶m(葡萄糖)=3∶1和4∶1時,最利于阿卡波糖合成;姜瑋等[9]研究表明:當麥芽糖質量分數小于6.0%時,發酵效價隨麥芽糖質量分數的上升而提高。另有研究顯示[11-13]:阿卡波糖的生物合成與補料培養基中氮源的種類和質量分數有密切關系,適宜的氮源補加有助于延緩菌體衰老,提升發酵水平。張琴等[12]研究發現:在阿卡波糖發酵過程中補入谷氨酸鈉并維持一定濃度,能提高阿卡波糖發酵單位;魏淑梅等[13]研究發現:在阿卡波糖發酵30～60 h時,單次或多次補入3.0%～3.6%麥芽糖可以顯著提高發酵單位,同時補加少量酵母膏有助于維持菌體正常生長。阿卡波糖是猶他游動放線菌的次級代謝產物,其生成與菌體生長具有相關性,在發酵前中期,菌體大量生長,可以較快進入次級代謝,產物合成速率較高,而在發酵后期,菌體開始衰老[14]。筆者在搖瓶水平上探究碳源及碳源、氮源復合補料對產阿卡波糖的影響,通過延緩菌絲衰老、維持較高的產物合成速率,進一步提升阿卡波糖的發酵水平,并為工業化發酵產阿卡波糖的補料優化控制提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

實驗所用阿卡波糖產生菌為猶他游動放線菌,菌株編號:AK-07,筆者公司保藏。

1.1.2 培 養 基

固體培養基:黃豆粉1.5 g,葡萄糖2.0 g,蛋白胨0.5 g,CaCO30.15 g,瓊脂1.5 g,用純化水定容至100 mL,pH調節至6.8～7.0,121 ℃高壓滅菌30 min。

種子培養基:黃豆粉2.0 g,土豆淀粉1.5 g,葡萄糖1.5 g,酵母浸出粉0.1 g,CaCO30.2 g,用飲用水定容至100 mL,pH調節至7.0,121 ℃高壓滅菌30 min。

發酵培養基:麥芽糖3.00 g,葡萄糖4.00 g,黃豆餅粉2.00 g,棉籽粉0.30 g;味精0.25 g,CaCl20.35 g,FeCl30.15 g,K2HPO40.20 g,CaCO30.25 g,用飲用水定容至100 mL,pH調節至6.8～7.0,121 ℃高壓滅菌30 min。

補料培養基:葡萄糖30.0 g,加入飲用水,加熱溶解后定容至100 mL,115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 儀器設備

脈動真空滅菌柜,XG1.GMX-0.36,購自山東新華醫療器械股份有限公司;恒溫培養箱,ZXSD-R1160,購自上海智誠分析儀器制造有限公司;超凈工作臺,SW-CJ-2F,購自蘇州安泰空氣技術有限公司;恒溫培養振蕩器,ZWYT-9200,購自上海智誠分析儀器制造有限公司;低速離心機,SC-3616,購自安徽中科中佳科學儀器有限公司;顯微鏡,CX21,購自奧林巴斯;高效液相色譜儀,Agilent1260,購自安捷倫;10 m3發酵罐,規格為3.6 m×1.8 m,1.0 m3發酵罐,規格為1.8 m×0.9 m,均購自杭州賽富特設備有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 搖瓶發酵

1) 種子培養

用接種鏟挖取0.5 cm×1.0 cm大小的斜面培養物,接種于裝有100 mL種子培養基的500 mL三角瓶中,于28 ℃在搖床上以250 r/min轉速振蕩培養48 h,制得種子培養液。

2) 發酵培養

將1)中種子培養液按10%接種量(以質量計,下同)接至裝有50 mL發酵培養基的500 mL三角瓶中,30 ℃,250 r/min振蕩培養7 d。

3) 補料控制

在發酵的72,96,120 h時分別補加碳源(葡萄糖和麥芽糖)、不同種類氮源及復合氮源,考察補料工藝對阿卡波糖發酵的影響。每組補料體積相同,補加量以質量分數計,均為補加后的發酵液中各組分的質量分數。

圖1 補料培養基優化過程示意圖Fig.1 The optimization process of feeding medium

1.2.2 相關參數的分析

阿卡波糖發酵單位的測定[15-16]:采用HPLC法測定,色譜柱為氨基柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為V(pH為6.0的0.01 mol/L磷酸緩沖溶液)∶V(乙腈)=30∶70,流速為1.5 mL/min,檢測波長為210 nm,柱溫為35 ℃,進樣量為10 μL。

菌體體積分數的測定:取發酵液10 mL于離心管中,3 500 r/min離心7 min,將上清液倒入另一10 mL離心管中,量取上清液的體積V1,菌體體積分數Q計算式為

Q=[(10-V1)÷10]×100%

2 結果與分析

2.1 補加麥芽糖對阿卡波糖發酵的影響

以菌株AK-07在發酵過程中的原補料工藝為對照組,原補料工藝為在搖瓶發酵72,96,120 h時分3次補入3.0%葡萄糖。實驗在對照組基礎上補加麥芽糖,在72,96,120 h時間點分別補加不同質量分數的麥芽糖(1.5%,3.0%,5.0%),從發酵第3天開始放瓶檢測效價,直至發酵培養至7 d結束。重復3批搖瓶實驗,取平均值,相對標準偏差(RSD)小于5%,結果如圖2所示。

圖2 補加不同質量濃度麥芽糖對阿卡波糖發酵的影響Fig.2 Effect of maltose supplementation with different mass fraction on acarbose fermentation

圖3 發酵液中麥芽糖質量分數Fig.3 The maltose mass fraction in fermenttation broth

由圖2,3可知:1) 補加麥芽糖的質量分數對發酵的影響無明顯差異。2) 對照組在發酵6 d后,效價不再增長且出現稍有下降的現象,可能與該菌株提前衰老以及自身糖代謝有關;實驗組在3～5 d進行麥芽糖補加,結果顯示在第4天效價會有一定提升,并在后期穩定增長,且補加3.0%麥芽糖的實驗組在第7天達到7 000 μg/mL,可見補加麥芽糖對阿卡波糖發酵有利。3) 對照組發酵液中麥芽糖質量分數逐漸降低,實驗組發酵液中麥芽糖有所積累,補加5.0%麥芽糖時,發酵液中麥芽糖補入量遠大于消耗量,累積在發酵液中,麥芽糖質量分數過高不利于阿卡波糖的合成,此外,補加麥芽糖影響發酵液的滲透壓,中后期滲透壓過高也不利于產物的合成。

2.2 氮源種類對阿卡波糖發酵的影響

在發酵中后期AK-07菌株菌絲出現衰老,產物合成速率降低,后期效價增長緩慢或出現效價倒跌的情況。因此,在上述補料配方優化的基礎上,考察在阿卡波糖發酵過程中(3～5 d)補加不同種類和質量分數的氮源,以減緩菌絲衰老,提高產物的合成量。對照組為只補加3.0%葡萄糖和5.0%麥芽糖,實驗組A,B,C,D和E分別為在對照組的基礎上補加黃豆粉、棉籽粉、蛋白胨、酵母膏和味精。發酵培養7 d,測定各實驗組的效價,重復3批搖瓶實驗,取平均值,RSD小于5%,氮源添加對阿卡波糖發酵的影響如表1所示。

表1 補加不同氮源對阿卡波糖發酵的影響

由表1可知:與對照組相比,補加黃豆粉和味精對阿卡波糖合成有一定提升,補加有機氮源黃豆粉和酵母膏對延緩菌絲衰老有作用,酵母膏在刺激菌體生長的同時明顯抑制次級代謝中產物的合成。黃豆粉最適添加量為0.4%,產物合成量提升10.7%;味精的最適添加量為0.05%,產物合成量提升8.7%。

2.3 添加銨鹽或味精對阿卡波糖發酵的影響

實驗組是在補加葡萄糖和麥芽糖的基礎上,分別添加銨鹽、0.025%的(NH4)2SO4、0.05%的CH3COONH4和0.05%的味精,銨鹽可用作氮源,并通過轉氨作用合成谷氨酸,對比補加銨鹽、味精對阿卡波糖發酵的影響,重復3批搖瓶實驗,取平均值,RSD小于5%,結果如表2所示。

表2 補加銨鹽、味精對阿卡波糖發酵的影響

2.4 補加復合氮源對阿卡波糖發酵的影響

2.1～2.3節的研究結果表明:補加葡萄糖后,再補加麥芽糖、黃豆粉、味精或(NH4)2SO4都對后期提升阿卡波糖效價有利,這些物質不僅能提供阿卡波糖合成的前體物質,而且能供給微生物生長代謝所需要的碳源和氮源,幫助延緩菌絲衰老,提高阿卡波糖發酵水平[17-20];此外,因味精與(NH4)2SO4添加后,對促進菌體生長,提高產物合成量的差異不明顯,考慮生產放大后原料的成本和安全性,實驗進行至72,96,120 h時分別補加復合氮源時選用黃豆粉和味精。重復3批搖瓶實驗,取平均值,RSD小于5%,不同補料方案對阿卡波糖發酵的影響如表3和圖4所示。

表3 不同補料方案對阿卡波糖發酵的影響

圖4 不同補料方案對阿卡波糖發酵的影響Fig.4 Effect of different feeding schemes on acarbose fermentation

由表3和圖4可知:補料配方為葡萄糖、麥芽糖和復合氮源時,后期效價跳幅平穩,7 d放瓶效價最優,達8 277 μg/mL,較單獨加黃豆粉或味精分別提高6.6%,9.7%,且加入黃豆粉后,菌絲衰老情況有所改善,后期效價增長較對照高,發酵延長至第8天,效價平穩,未有明顯倒跌。

2.5 補料控制工藝在中試中的應用

在中試放大實驗中,分別在發酵72,96,120 h時補入優化后的補料配方,考察該補料工藝在菌株AK-07發酵產阿卡波糖中的作用。將菌株接種搖瓶種子培養后,首先接入種子罐培養,然后移種至10 m3發酵罐培養,接著分別培養至約72,96,120 h,最后補加按一定比例配方組成的葡萄糖、麥芽糖和復合氮源的補料。對照組為原補料配方,即只補加葡萄糖,實驗組為優化后的補料配方,從培養第4天開始取發酵液檢測阿卡波糖質量濃度,結果如圖5所示。

圖5 補料優化工藝在中試中的應用Fig.5 Application of feeding process in pilot test

由圖5可知:在中試發酵中優化后的補料工藝能明顯提高后期的發酵水平,發酵至第8天效價達8 048 μg/mL,較對照組提高20.4%,而對照組在發酵第7天發酵水平達到最高6 978 μg/mL,第8天發酵水平下降。因此,優化后的補料工藝較原工藝有明顯優勢。

3 結 論

AK-07菌株具備發酵前期產物合成速率較快的優勢,然而在發酵后期會出現菌絲衰老的情況,導致后期效價增長速率減慢甚至出現倒跌情況。為提升發酵水平,筆者在搖瓶發酵中優化AK-07菌株發酵過程中補料培養基的成分與配比。實驗結果表明:在發酵72,96,120 h時補加質量分數為3.0%的葡萄糖和1.5%的麥芽糖的基礎上補加復合氮源(0.4%黃豆粉和0.05%味精),此時阿卡波糖的合成量最大,搖瓶發酵水平較只補葡萄糖和麥芽糖實驗組提高13.4%,達8 227 μg/mL,在10 m3發酵中發酵培養8 d后,實驗組發酵水平較對照組提高了20.4%。麥芽糖作為前體物質直接參與阿卡波糖的合成,發酵液中未被利用的麥芽糖參與維持發酵液的滲透壓,然而較高的滲透壓不利于產物的合成,因此發酵中后期需維持麥芽糖在適宜的質量濃度才能提高阿卡波糖的發酵水平;味精提供的谷氨酸是阿卡波糖中氮元素的來源,而和黃豆粉組合成復合氮源在阿卡波糖發酵中后期補入,能延緩菌絲衰老,提高后期阿卡波糖發酵水平。筆者優化了阿卡波糖發酵過程中的補料配方,針對這種本身具有較大產能潛力的菌種,該配方能延緩菌絲衰老,延長發酵周期,明顯提升阿卡波糖發酵水平,為該菌種后續的工業放大生產提供了數據支撐,也為阿卡波糖生產菌種在工業化生產中提供了一種補料思路。