HPV E6/E7在自噬調控中的作用機制研究進展

楊二琴,黨曉慶,王志蓮

自噬在病毒感染的反應中調節細胞命運[1],在維持細胞穩態和功能中發揮關鍵作用[2]。大量證據表明,自噬不僅對氧化應激、DNA損傷、缺氧、營養缺乏、內質網應激以及外源生物或藥物的暴露做出一系列適應性反應,以維持體內平衡,而且還參與了人類疾病的發展,包括癌癥、腦卒中、神經退行性疾病等[3-5]。在鱗狀細胞癌癌變發生早期,人乳頭瘤病毒E6/E7蛋白(human papillomavirus E6/E7 protein,HPV E6/E7)可抑制自噬,而在后期E6/E7可重新激活自噬[3],E6/E7可通過多條途徑使自噬標志物LC3-II減少和P62積累,來阻止自噬溶酶體的降解,從而抑制自噬[6]。宮頸癌的發生發展與HPV密切相關,為探討HPV E6/E7在自噬調控中的作用,為宮頸癌等HPV相關疾病的診斷及靶向治療提供一定的思路,本文將對HPV E6/E7在自噬調控中的機制展開綜述。

1 E6/E7通過視網膜母細胞瘤蛋白p53、pRb調控自噬

研究表明,p53可通過激活參與啟動和形成自噬小體的關鍵基因蛋白ULK 1、ATG7以及DRAM觸發自噬,還可通過激活AMPK激活子1和激活子2等基因來觸發自噬[7-8]。HPV E6/E7可以降解p53和pRb,從而調控自噬。HPV E6可引起p53降解,使p53功能喪失,從而導致自噬下調。高危型HPV(high-risk human papillomavirus,HR-HPV)E7可降解pRb,同時釋放轉錄因子E2F,轉錄因子E2F可以誘導LC3、ULK1、ATG5和DRAM的轉錄[9],導致自噬的上調?？傊?HR-HPV E6可以降解p53,下調自噬,E7可降解pRb,上調自噬。

2 E6/E7通過PI3K-AKT-mTOR通路調控自噬

E6/E7可激活并維持PI3K-AKT-TOR通路來抑制自噬。HPV16 E6/E7與表皮生長因子受體(EGFR)作用可激活PIK3CA/PI3K-AKT-mTOR軸,從而抑制自噬,HPV E6的異位表達通過抑制AKT-mTOR和MAPK/ERK-mTOR通路誘導自噬[10]。HPV16 E7蛋白可與蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)的亞基結合,阻止PP2A與磷酸化Akt(p-Akt)的相互作用并保持其活性,E6也可以激活Akt,從而維持PI3K-AKT-mTOR通路來抑制自噬,E6還可與TSC2結合,導致其降解并刺激mTORC1[11-12],而磷酸化的mTORC1可以抑制自噬[13]。

3 E7通過調節beclin-1調節因子1(AMBRA1)調控自噬

E7通過競爭性結合AMBRA1及促進AMBRA1降解抑制自噬。與HPV陰性腫瘤相比,AMBRA1的表達和細胞自噬水平在HPV陽性腫瘤中均降低,這說明AMBRA1可能對細胞自噬有調控作用[14]。beclin-1是促自噬PIK3C3/VPS34復合物的一種成分,AMBRA1的中心區域與beclin-1結合,從而促進自噬,HPV16 E7以不同于AMBRA1結合beclin-1的方式直接結合于AMBRA1[15],HPV16 E7通過表達降低了AMBRA1與beclin-1的相互作用,這表明HPV16 E7和beclin-1在競爭AMBRA1蛋白上的相同結合區域。此外,HPV16 E7可以由鈣蛋白酶依賴性方式介導AMBRA1的降解,從而抑制自噬。有研究證明鈣蛋白酶2(CAPN2)通過降解兩種自噬關鍵蛋白ATG3和ATG7來抑制自噬[16],該研究發現CAPN2與AMBRA1相互作用,而HPV16 E7表達增加了AMBRA1-CAPN2相互作用,這表明AMBRA1降解是通過CAPN2觸發的[16]?？傊?HPV E7與AMBRA1相互作用、競爭其與beclin-1結合并觸發其鈣蛋白酶依賴性降解的能力來抑制自噬。

4 E6/E7直接調節自噬相關蛋白調控自噬

E6可以直接上調自噬相關蛋白基因轉錄及蛋白表達促進自噬,E7可以直接上調自噬相關蛋白表達促進自噬。Tingting等[17]發現,HR-HPV E6/E7通過調節SiHa和Caski細胞中自噬相關蛋白水平可以直接激活自噬,HPV16 E6可能在轉錄水平上調節參與自噬小體形成和運輸的ATG9蛋白和參與自噬小體-溶酶體融合的LAMP-1,HPV16 E6對HEK293細胞中的Atg9B和LAMP1的轉錄具有正調控作用,當HPV16 E6過度表達時,Atg9B和LAMP1-mRNA均增加。另有研究表明,與對照細胞相比,在表達E6的細胞中,催化ATG12-AT5組裝的ATG10酶表達上調,自噬標記物Beclin-1和LC3-II增加,而P62保持較低水平,這表明E6對自噬有誘導作用[10]。HPV16 E7可以直接與ATG9和LAMP-1結合,并可促進ATG9B和LAMP1的表達,通過免疫沉淀分析發現HPV16 E7與Atg9B相互作用,而不與LAMP1相互作用,HPV16 E7和Atg9B之間的相互作用促進了自噬溶酶體的形成和降解,從而促進自噬[17]。據報道,在宮頸鱗狀上皮內病變組織中,HPV16 E6/E7隨著病變級別的升高表達增加,而ATG12表達水平隨著病變級別的升高反而呈下降趨勢[18-19]。ATG12在HPV陰性的頭頸部鱗狀細胞癌中表達缺失,可以減少頭頸部鱗狀細胞癌的缺氧狀態,通過碳源及谷氨酰胺依賴途徑維持缺氧狀態下細胞的生存,并改善腫瘤預后[20]。因此,HPV E6/E7可能通過上調ATG12的表達來調節自噬。

5 E6/E7通過調節衰老基因表達調控自噬

E6/E7可抑制衰老相關基因表達從而抑制自噬。E6/E7的耗竭會誘導W12宮頸角質形成細胞自噬,同時觀察到W12宮頸角質在轉染E7敲低模型后,衰老標記物β-半乳糖苷酶在所有W12宮頸角質系列受試細胞中的平均表達率較對照組顯著增高[21],這說明自噬的誘導與細胞衰老有關。實驗表明,E6/E7的缺失可以誘導衰老表型、衰老相關分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)以及固有免疫應答上調,從而引起自噬基因上調,促進自噬[21]。這與衰老和先天免疫反應途徑的富集有關,HPV E6/E7缺失后,SASP上調[22],該基因可以招募能夠清除衰老細胞的先天免疫細胞,上調SASP相關mRNA(如IGFBP3和SERPINE1)以及與先天免疫反應相關的因素,包括細胞因子(如IL1β)和干擾素刺激基因[23],從而促進自噬。

6 E6/E7通過泛素蛋白酶體系調節自噬

E6/E7通過抑制泛素蛋白酶體系來上調自噬。E6和E7都是蛋白酶體介導的降解目標,E6募集泛素連接酶(E6-associated protein,E6AP)靶向介導p53進行蛋白酶體介導的降解,E6可以類似地由E6AP靶向介導進行自身降解[24]。E7募集ZER1/CUL2-RING泛素連接酶復合物以促進pRb的降解,E7也通過SOCS1接頭復合物和/或SCF(Skp-Cullin-F box)泛素連接酶復合物(包含Cullin1和Skp2)來介導靶向自身降解[25-26]。E6和E7分別是去泛素酶(DUB) USP11和USP15的靶標,并且E6和E7與涉及泛素化和去泛素化的因子相關[27-28]。蛋白酶抑制劑降低靶向這些病毒癌蛋白DUB的水平或活性,從而導致E6和E7泛素化增加,增加其降解。通過觸發蛋白酶抑制劑,可以逆轉HPV16驅動的細胞自噬標志物的積累,從而誘導自噬[29]。因此,E6/E7可觸發蛋白酶抑制劑來抑制泛素蛋白酶體系從而誘導自噬。

同時,蛋白酶抑制劑誘導的自噬對控制內質網應激很重要,而內質網應激又可以激活自噬。當蛋白質不能正確折疊時,錯誤折疊的蛋白和未折疊蛋白可以通過內質網相關降解通路(ERAD)降解,如果未折疊蛋白持續積累,細胞會激活自噬。一旦內質網應激反應開始并進展,細胞可以嘗試通過激活自噬途徑來降解累積的蛋白質從而恢復內質網穩態[30]。因此,內質網應激也可激活自噬。

7 E6/E7通過調節線粒體損傷調控自噬

CararoLopes等[31]研究提示,在HRasG12V活性下的HPV E6/E7角質形成細胞中,HPV E6/E7蛋白降解p53和pRb的活性被抑制,但高HRasG12V活性下啟動了一系列應激,導致有絲分裂信號的不協調,進而導致復制損傷和氧化應激,兩者都導致了DNA損傷,進而引起線粒體損傷。此時,為清除受損線粒體、減少氧化應激,E6/E7會激活自噬。因此,E6/E7可能通過調節線粒體損傷來調控自噬,自噬可能通過調節線粒體損傷來發揮作用。

HPV E7通過CerS1/神經酰胺依賴的線粒體自噬誘導細胞死亡。通過HPV E7信號通路,以線粒體為靶點的c18神經酰胺介導線粒體自噬,HPV E7抑制Rb信號是調控神經酰胺依賴性致死線粒體自噬的關鍵,HPV E7神經酰胺介導的線粒體自噬是由E2F5-Drp1復合物誘導的,HPV E7通過抑制Rb激活E2F5,增強了神經酰胺誘導的線粒體自噬,HPV16 E7通過激活細胞質E2F5功能,選擇性介導HNSCC細胞死亡,瞄準Rb激活的E2F5,使其結合并穩定Drp1寡聚體作為支架分子,誘導Drp1線粒體轉位和線粒體分裂,導致含有LC3的自噬體的神經酰胺募集和隨后的線粒體自噬[32]。

8 總結與展望

E6/E7調控自噬存在兩面性。一方面,自噬使得腫瘤細胞能夠耐受生存腫瘤微環境的應激(缺氧、高能量需求等)和毒性治療。另一方面,自噬對于減少可促進腫瘤發生的基因組損傷非常重要。HPV E6/E7對自噬的調節表現為既能上調又能抑制自噬,可能是HR-HPV和LR-HPV E6/E7對自噬的影響存在差別以及時間順序依賴性的表現不同。有研究表明HR-HPV和LR-HPV都可以調節自噬,在病毒感染過程中,早期階段HR-HPV E6/E7抑制自噬,以阻止病毒的清除,在后期階段,HR-HPV E6/E7蛋白為滿足與癌細胞代謝相關的需求,在癌癥發展和維持過程中可能會重新激活自噬[33-34]。關于LR-HPV,有研究者認為在病毒感染過程可以激活自噬,以增加細胞能量需求或消除未折疊和錯誤折疊的宿主蛋白。與來自HR-HPV的E6相反,來自LR-HPV11的E6通過誘導Akt和mTORC1蛋白去磷酸化而失活,此外,來自HPV11的E6促進細胞外信號調節激酶(ERK)的去磷酸化和失活,從而下調mTORC1水平,促進自噬誘導。這些結果表明,LR-HPV中的E6通過AKT-mTOR和ERK-mTOR的下調促進自噬[10]。

HPV E6/E7對自噬的調節表現出兩面性,這也可能是HPV E6/E7功能拮抗的表現。研究表明,HR-HPV的E6和E7可以不同地調節氧化應激(OS),其中E6可誘導OS和DNA損傷,而E7可以保護OS,減少氧化環境[35-36]。在上皮-間充質轉化(EMT)過程中,E6促進EMT,而E7降低EMT[37],當兩種蛋白質都過表達時,它們的作用被中和[35-36],因此HPV E6/E7對自噬調節的表現受E6/E7功能相對強弱的影響而表現為既能上調自噬又能抑制自噬。

目前對HPV E6/E7在自噬過程中的作用相關研究還待深入,不同調節通路之間是否存在共同部分及如何相互影響需進一步明確。HR-HPV與LR-HPV E6/E7表達差異及生物學行為差異可能導致了對自噬調節的差異。E6/E7對自噬過程中的不同環節均有影響,E6/E7對自噬具體的調節方式、調節通路還需更多的研究來明確,HPV E6/E7在自噬中的作用到底如何,以及這兩種蛋白發揮激活與抑制作用的具體環境及條件,需要進一步研究探討。