KDM6A在乳腺癌中的表達及其對相關惡性細胞生物學行為的研究

謝 強,錢 軍,張立功,殷發祥,儲云綿,許 睿

(蚌埠醫學院第一附屬醫院腫瘤外科中德乳腺病區,安徽 蚌埠 233000)

乳腺癌是世界上女性最常見的癌癥,大約10%的女性在其一生中會被診斷出乳腺癌[1]。隨著女性年齡的增長,患乳腺癌的風險也會增加[2]。最新研究表明,70至74歲之間是女性乳腺癌高發年齡段,并且也是40多歲女性死亡的主要原因,目前乳腺癌已成為女性癌癥死亡的第二大常見原因[3-4]。因此,闡明乳腺癌發生發展機制,為乳腺癌患者提供新的治療策略,具有重要意義。

組蛋白翻譯后修飾是調控基因轉錄的重要步驟,組蛋白異常修飾已與多種人類疾病的發病機制相關,其中一些已被證明是潛在的診斷生物標志物或治療靶點[5]。KDM6A也稱為UTX,屬于組蛋白h3賴氨酸27 (Histone H3 Lysine 27,H3K27)去甲基化酶KDM6家族[6]。KDM6A蛋白包含6個TPR結構域和一個酶促JmjC結構域,催化去除H3K27上的二甲基化和三甲基化[7]。已有研究報道,KDM6A突變與部分實體腫瘤的發生發展相關,如膀胱癌、非小細胞肺癌、胰腺癌等[8-10],但KDM6A在乳腺癌中的作用尚不清楚。本實驗通過過表達乳腺癌細胞中KDM6A基因,觀察其對乳腺癌細胞惡性生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑乳腺癌細胞MDA-MB-468,SKBR-3,MCF-7以及人正常乳腺細胞MCF-10A購于ATCC細胞庫;KDM6A、Bcl-2、Bax、Caspase-3、GAPDH一抗、IgG二抗均購于中國武漢三鷹公司;SYBR Green及反轉錄試劑盒由日本TAKARA公司生產;Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒及Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒由中國上海碧云天科技有限公司生產;引物及pcDNA3.0-KDM6A載體構建由中國蘇州吉瑪基因公司提供;Transwell小室、96孔板、24孔板、6孔板均購自美國Corning公司。

1.2 標本來源收集蚌埠醫學院第一附屬醫院2023年1月至2023年3月于腫瘤外科行乳腺癌改良根治術的女性患者18例。手術切除乳腺癌組織及癌旁正常組織(距離癌切緣≥3 cm)后,即刻放入-80 ℃ 冰箱保存,直至提取RNA或蛋白質。入組病人均有明確的病理診斷為乳腺癌,且術前均未接受過任何新輔助治療。所有患者均簽署知情同意書,并由蚌埠醫學院第一附屬醫院倫理委員會批準。

1.3 細胞培養及轉染乳腺癌細胞MCF-7培養于DMEM完全培養基(含10%胎牛血清和1%的青鏈霉素),于37 ℃,5% CO2的培養箱中培養,細胞貼壁生長至培養瓶面積的85%時進行傳代。取對數生長期細胞,使用脂質體Lipo3000,將pcDNA3.0-NC及pcDNA3.0-KDM6A轉染至細胞。細胞分組:control組(未轉染組),pcDNA3.0-NC組(轉染空載體組),pcDNA3.0-KDM6A組(轉染KDM6A片段組)。

1.4 qRT-PCR檢測RNA相對表達水平取相應細胞或組織,TRIzol試劑提取總RNA,按反轉錄試劑盒操作逆轉錄為cDNA。為cDNA為模板,加入引物,將GAPDH設為內參,按2-△△Ct計算方法得出KDM6A相對表達水平。循環反應條件:變性94 ℃15 s,退火59 ℃30 s,延伸76 ℃40 s,共40個循環。引物序列:KDM6A正向序列:5'-CAGATCCAAATTCTGGCCAGTCC-3';反向序列:5'-CAGAAGCAAGTGCAGATACATGG-3'。GAPDH正向序列:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3';反向序列:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。

1.5 Western blot檢測蛋白相對表達水平取組織或各組處理后的細胞,Ripa裂解液冰上操作提取總蛋白質,通過BCA試劑盒測定濃度后調整各組總蛋白量,10%SDS-PAGE電泳分離蛋白質。濕轉至PVDF膜。取出PVDF膜,置于5%脫脂牛奶搖床封閉,室溫下1 h。TBST清洗后加入一抗(1∶1 000),4 ℃冰箱靜置過夜。TBST洗去一抗,加入二抗(1∶2 000)室溫搖床孵育1 h。根據ECL試劑盒進行顯影。以GAPDH為內參,Image軟件分析目的條帶與內參條帶灰度值的比值來計算目的蛋白相對表達量。

1.6 CCK-8檢測細胞增殖水平取各組對數生長期細胞,將細胞濃度配置成1×105個/mL,取200 μL接種于96孔板中,每個樣品設置3個復孔,置于培養箱中。于12 h,24 h,36 h,48 h時通過酶標儀檢測450 nm處的光密度值(optical density,OD),統計繪制折線圖。

1.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡率取各組對數生長期細胞,按Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明,分別在細胞中加入5 μL PI和5 μL Annexin Ⅴ-FITC,室溫避光孵育20 min,通過流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況。

1.8 Transwell檢測各組細胞侵襲水平提前12 h配置好matrigel基質膠鋪于transwell小室底部。用無血清培養基將細胞濃度設為2×104個/μL,取各組細胞200 μL置于上室,700 μL完全培養基置于下室中。培養箱孵育24 h,甲醇固定,結晶紫染色。倒置顯微鏡隨機捕獲5個視野,在高倍鏡(400×)下觀察細胞并計數。

1.9 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移改變取對數生長期的各組細胞系,將細胞濃度配置成1×106個/mL,取1 mL接種至6孔板中,當細胞貼壁生長融合后,使用無菌槍頭在6孔板中央劃痕,PBS清洗后,通過無血清培養基繼續培養細胞。在0 h和24 h采用倒置相差顯微鏡下拍照,觀察細胞劃痕愈合情況,計算劃痕愈合率。

1.10 統計學分析采用統計學軟件SPSS 22.0分析數據,率的比較采用卡方檢驗,計量資料以“均數±標準差”表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析。每組實驗重復三次,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KDM6A在乳腺癌及癌旁正常組織中表達情況qRT-PCR檢測發現,乳腺癌組織中KDM6A表達量較癌旁正常組織顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05),如圖1A。Western blot檢測KDM6A蛋白在乳腺癌組織中表達,在3組乳腺癌及對應癌旁正常組織中,癌組織KDM6A蛋白表達較癌旁正常組織顯著提高(P<0.05),如圖1B。

圖1 乳腺癌組織與癌旁正常組織中KDM6A表達水平

2.2 KDM6A在乳腺癌細胞中的表達及轉染驗證由western blot檢測得出,MCF-7,MDA-MB-468,SKBR-3細胞中KDM6A蛋白表達較MCF-10A中顯著降低(P<0.05),如圖2A。因此,本研究對表達量最低的MCF-7細胞的KDM6A過表達。qRT-PCR檢測可見,與control組相比,KDM6A表達水平在pcDNA3.0-NC組中無差異,而在pcDNA3.0-KDM6A組中明顯升高(P<0.05),證明轉染成功,如圖2B。

圖2 檢測正常乳腺及乳腺癌細胞中KDM6A表達情況及過表達MCF-7細胞中KDM6A驗證

2.3 CCK-8檢測KDM6A對乳腺癌細胞增殖作用CCK-8實驗結果得出,pcDNA3.0-NC組與control組相比,細胞增殖能力無顯著差異;pcDNA3.0-KDM6A組與control組相比,細胞增殖能力顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05),如圖3。

圖3 CCK-8實驗檢測MCF-7細胞增殖能力改變

2.4 流式細胞儀檢測KDM6A對乳腺癌細胞凋亡影響流式細胞儀檢測結果得出,pcDNA3.0-NC組與control組相比,細胞凋亡能力無顯著差異;pcDNA3.0-KDM6A組與control組相比,細胞凋亡能力顯著提高,差異有統計學意義(P<0.05),如圖4。

2.5 Transwell檢測細胞侵襲能力改變Transwell實驗結果得出,pcDNA3.0-NC組與control組相比,細胞侵襲能力無顯著差異;pcDNA3.0-KDM6A組與control組相比,細胞侵襲能力顯著下降,差異有統計學意義(P<0.05),如圖5。

圖5 Transwell檢測MCF-7細胞侵襲能力改變

2.6 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力改變劃痕愈合實驗結果得出,pcDNA3.0-NC組與control組相比,細胞遷移能力無顯著差異;pcDNA3.0-KDM6A組與control組相比,細胞遷移能力顯著下降,差異有統計學意義(P<0.05),如圖6。

圖6 劃痕愈合檢測MCF-7細胞遷移能力改變

2.7 KDM6A影響MCF-7細胞凋亡通路的蛋白變化Western blot實驗結果得出,pcDNA3.0-NC組與control組相比,Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達量無明顯差異。pcDNA3.0-KDM6A組與control組相比,Bcl-2蛋白表達量顯著下降,而Bax、Caspase-3蛋白表達量顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05),如圖7。

圖7 Western blot 檢測KDM6A對凋亡信號通路相關蛋白的影響

3 討論

乳腺癌是世界范圍內診斷頻率最高的癌癥,也是女性癌癥死亡的主要原因[11]。乳腺癌組織由腫瘤細胞、免疫細胞和基質細胞組成,具有不同的表觀遺傳和表型特征[12]。異質性腫瘤細胞亞群通過選擇和進化,促進腫瘤細胞進展,并獲得治療耐藥性[13]。最新研究表明,隨著各種腫瘤靶向指標的檢測,乳腺癌早期診斷、手術切除及中晚期乳腺癌患者新輔助治療,內分泌治療及靶向治療技術的發展[14-15],乳腺癌的治療在過去的幾十年里有了顯著的進步。然而,乳腺癌的死亡率仍然很高,主要是因為癌癥的惡性細胞的特性,如無限制的增殖、轉移和對凋亡的抵抗[16]。乳腺癌進展的過程及機制是復雜的,因此,需要進一步研究潛在的分子機制,以確定乳腺癌的新分子靶點。

KDM6A也被稱為X染色體四肽重復蛋白,是人類重要的表觀遺傳調控因子。功能上,KDM6A催化三甲基化組蛋白H3賴氨酸27 (H3K27me3)的去甲基化[17]。近年來,已有研究表明,在多種癌癥中發現KDM6A突變,例如,在體外實驗中,KDM6A已被證明可以抑制膀胱癌細胞的增殖和生長,在臨床實驗中,KDM6A的下調被證明與膀胱癌的晚期進展密切相關,KDM6A水平的降低和突變都預示膀胱癌的不良預后[18-19]。在胰腺癌中,Yang等人發現[20],KDM6A在胰腺癌組織中表達較胰腺正常組織明顯降低,且KDM6A通過CXCL1抑制胰腺癌細胞增殖及侵襲。而在乳腺癌中,KDM6A的作用則鮮有人研究,因此,本文通過檢測乳腺癌中KDM6A表達并研究KDM6A對乳腺癌細胞相關惡性生物學行為,從而尋求乳腺癌治療的潛在靶點。

此次研究前期通過qRT-PCR及western blot,發現KDM6A在乳腺癌組織中表達降低。其次為探究KDM6A對乳腺癌細胞惡性生物學行為的影響,本實驗使用pcDNA3.0-KDM6A載體過表達MCF-7細胞中KDM6A表達量,由CCK-8實驗及流式儀檢測得出,過表達KDM6A后,MCF-7細胞增殖能力顯著降低,凋亡率明顯提高。由Transwell及劃痕愈合實驗得出, KDM6A過表達后,MCF-7細胞侵襲及遷移能力均降低。為深入探究細胞凋亡改變機制,本課題組通過western blot方法檢測凋亡信號通路相關蛋白表達,發現過表達KDM6A后,MCF-7細胞中Bcl-2蛋白表達量顯著下降,而Bax、Caspase-3蛋白表達量明顯升高。這些結果表明,KDM6A可能通過凋亡信號通路相關蛋白影響乳腺癌的進展。但此次研究仍有一些局限性,首先缺乏動物實驗對體內情況進行驗證,其次探討機制過于簡單,仍需要進一步探討。

綜上所述,由此本課題組認為,KDM6A在乳腺癌組織中低表達,過表達KDM6A可抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲及遷移,并提高細胞凋亡率,這可能與KDM6A調控凋亡相關蛋白具有相關性。因此,KDM6A可能作為一個潛在的分子生物學標志物,為深入研究乳腺癌奠定基礎,同時可能成為乳腺癌精準治療提供新靶點,提升乳腺癌治愈率。