Hsa_circ_0000741對乳腺癌癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及分子機制

馬思源,張博超,朱 萍,趙曉曉,浦 春

(1.皖南醫學院第一附屬醫院檢驗科;2.皖南醫學院檢驗學院,安徽 蕪湖 241000)

乳腺癌(Breast Cancer,BC)是女性中最常見的惡性疾病,嚴重威脅著全世界女性的健康[1]。乳腺癌是由于女性(或男性)乳房中導管或小葉細胞的惡性轉化引起的,其遺傳、表型和形態異質性對腫瘤的增殖、遷移和侵襲有影響[2]。環狀RNA(circRNA)是一類新的內源性調節RNA,其特征是共價閉合的環狀結構,缺乏多腺苷酸化的尾巴,能夠在轉錄或轉錄后水平上調節基因表達[3]。最近的研究發現,circRNA可能參與多種癌癥的調控機制,包括結直腸癌、肝細胞癌、乳腺癌和胰腺導管腺癌[4]。CircRNA可參與乳腺癌的多種病理過程,使用circRNA作為乳腺癌生物標志物正在得到認可[5-6]。Has_circ_0000741作為一個新的circRNA,目前在乳腺癌中的作用機制不明,本研究旨在探尋has_circ_0000741是否影響乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

1 材料與方法

1.1 材料乳腺癌癌細胞株MCF-7、MDA-MB-231購自中國科學院上海細胞庫;胎牛血清、DMEM培養基(南美Gibico);胰蛋白酶(biosharp公司);逆轉錄和熒光定量PCR試劑盒 (寶生物工程(大連)有限公司和寶日醫生物技術(北京)有限公司); PCR引物 (生工生物工程(上海)股份有限公司);Trizol 試劑(生工生物工程(上海)股份有限公司);siRNA(廣州銳博生物技術有限公司);銳博轉染試劑(廣州銳博生物技術有限公司);Transwell小室、基質膠(美國BD公司);CCK-8試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);結晶紫染液(sigma-aldrich西格瑪奧德里奇貿易有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學 利用GEO數據庫中GSE182471和GSE165884數據集中的circRNA表達量數據,并利用R語言中的limma包對circRNA數據集分析,得出hsa_circ_0000741一系列的差異顯著基因,明確hsa_circ_0000741在乳腺癌與癌旁組織中表達的顯著差異。

1.2.2 細胞處理與分組 使用含有青霉素/鏈霉素雙抗的10% FBS(Fetal bovine serum)的高糖DMEM在37 ℃,5% CO2的條件下培養乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231,分別將si-nc、si-circ_0000741通過lipo2000試劑轉染至MCF-7、MDA-MB-231細胞中,37 ℃,5% CO2的條件下孵育1 d,記為 si-nc組、si-circ_0000741組,并測定各組hsa_circ_0000741表達量,觀察si-circ_0000741組表達量是否下降。

1.2.3 qRT-PCR 使用TRIzol試劑提取si-nc、si-circ_0000741組MCF-7、MDA-MB-231細胞的總RNA,反轉錄成cDNA,按試劑盒說明進行PCR;采用2-△△Ct法計算相對表達量,hsa_circ_0000741引物的正向序列為5′-tggtccctcgcatgattgtcac-3′,反向序列為5′-gagttggctgccggttgaag-3′。

1.2.4 CCK-8實驗 取生長良好的MCF-7、MDA-MB-231細胞接種于96孔板,每組設置5個復孔,每個復孔接種6 000個細胞,每組轉染后,分別于培養0 h、24 h、48 h、72 h、96 h時,每孔加入10 μL CCK-8溶液, 37 ℃培養1 h,使用酶標儀于450 nm處測定光密度(optical density,A)值。

1.2.5 集落形成實驗 對于集落的形成進行測定,將1×103數量MCF7和MDA-MB-231細胞接種到6孔板中。孵育2周后,用多聚甲醛固定菌落30 min,并在室溫下用0.1%結晶紫(Sigma)染色。對細胞菌落進行計數和成像。

1.2.6 劃痕實驗 取生長良好的MCF7和MDA-MB-231細胞接種至6孔板,24 h后各組分別進行轉染,待細胞長到100%匯合度時,用200 μL無菌槍頭劃破細胞的中軸,移液管吸取用PBS沖洗滑落下來的細胞,保證邊緣整齊,倒置顯微鏡下觀察拍照,用無菌吸頭加入無血清培養基繼續培養。并在0 h、24 h和48 h 3個時間點,使用倒置顯微鏡拍攝傷口愈合情況。

1.2.7 Transwell實驗 將100 μL稀釋的Matrigel膠加入transwell小室上方,置于培養箱中孵育2 h。將1.5×105數量的各組MCF7和MDA-MB-231細胞懸浮在200 μL無血清培養基中,并接種到Transwell的上室中。使用500 μL含有20%FBS的DMEM細胞培養基培養基填充下室。將細胞在37 °C的5% CO2培養箱中孵育24 h,孵育后,用棉簽除去頂部室中的細胞,并用多聚甲醛固定侵入下表面的細胞,用0.1%結晶紫染色,并在顯微鏡下以100×放大倍率拍照。

1.3 統計分析用SPSS 17.00、GraphPad Prism 8.0統計學軟件進行統計學分析。計量資料以“均數±標準差”表示,兩組獨立樣本之間的比較采用t檢驗的方法,以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hsa_circ_0000741在GEO數據集中差異表達數據集GSE182471中的5個乳腺癌組織和5個相鄰正常乳腺組織中具有顯著差異表達的cirrna(|Fold change|>2,adj.Pvalue<0.05)共978個(圖1A),在數據集GSE165884中的4個乳腺癌組織和4個相鄰正常乳腺組織中具有顯著差異表達的cirrna(|Fold change|>2,adj.P.value<0.05)共575個(圖1B),將兩個數據集篩選出的差異基因取交集得到111個circRNA(圖1C)。

圖1 數據集篩選差異基因

2.2 hsa_circ_0000741表達在乳腺癌細胞系高于正常乳腺細胞提取生長狀態良好的MCF-7、MDA-MB-231乳腺癌細胞系與正常乳腺細胞MCF-10A細胞的總RNA進行qRT-PCR,以MCF-10A的結果為對照可以發現hsa_circ_0000741在乳腺癌細胞系中的表達量比在正常細胞系中的表達量有顯著提高,MCF-7中的表達量為MCF-10A中的2.17倍,MDA-MB-231中的表達量是MCF-10A中的3.9倍(圖2)。

圖2 Hsa_circ_0000741在MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231三種細胞中的表達量

2.3 hsa_circ_0000741敲低乳腺癌細胞株的構建提取轉染24 h的si-nc、si-circ_0000741組MCF-7、MDA-MB-231細胞的總RNA進行qRT-PCR檢測siRNA的轉染效率,qRT-PCR結果顯示,以si-nc為對照,轉染了si-circ_0000741后,MCF-7細胞中hsa_circ_0000741表達水平顯著降低3.7倍,MDA-MB-231細胞中hsa_circ_0000741表達顯著下調3.4倍,表明si-circ_0000741轉染成功(圖3)。

圖3 Si-hsa_0000741在MCF-7和MDA-MB-231中的轉染效率

2.4 hsa_circ_0000741的表達促進了乳腺癌細胞的增殖集落形成實驗中,si-hsa_circ_0000741組所形成的乳腺癌細胞集落明顯少于control和si-nc組,其中以control組形成集落數最多(圖4A、4C),而在CCK-8實驗中,與control和si-nc對照組相比,轉染了si-hsa_circ_0000741的細胞OD值的增長速率明顯落后,表面其增殖速度明顯落后于control和si-nc組,其中以control組增殖速率最為顯著(圖4B、4D)。

圖4 轉染si-hsa_circ_0000741后的集落形成和增殖能力

2.5 hsa_circ_0000741的表達促進乳腺癌細胞的遷移、侵襲劃痕實驗顯示si-circ_0000741組乳腺癌細胞的愈合速率要顯著低于control和si-nc組,癌細胞的遷移速率顯著下降,其中control組愈合速率最快(圖5A、5C),通過侵襲實驗可以發現si-circ_0000741組遷移到下室的乳腺癌細胞要少顯著少于control和si-nc組,而control組遷移到下室的細胞數目最多,癌細胞侵襲能力顯著削弱(圖5B、5D)。

圖5 轉染si-hsa_circ_0000741后的增殖和侵襲能力

3 討論

乳腺癌是全世界女性中最常見的惡性腫瘤,約70～80% 的早期非轉移性疾病患者可治愈[7],近年來我國的乳腺癌發病率逐年攀升,根據最新統計數據,我國每年新增乳腺癌患者約42萬人,已成為中國女性高發惡性腫瘤之一,而伴有遠處轉移的晚期乳腺癌往往被認為無法治愈。根據分子和組織學證據,乳腺癌可分為三組;激素受體陽性(HR+)、HER2+和三陰性乳腺癌(TNBC)(ER+++-,PR-,HER2-)[8-9],與其他乳腺癌組相比,其中TNBC的治療最具挑戰性。對于乳腺癌來說,最重要的預后指標是腋窩淋巴結轉移的存在和數量。然而,腋窩淋巴結受累的程度并不能決定疾病的結局[10],另外兩個重要的預后指標是;腫瘤大小和腫瘤分級已被廣泛使用,由于我們正在經歷個性化治療的時代,這些判斷預后的獨立指標(腫瘤大小、腫瘤分級和淋巴結轉移)已經不足以對乳腺癌患者進行早期診斷[11-12]。近年來,許多研究致力于尋找和驗證分子生物標志物,以作為預后和預測生物標志物。

環狀RNA(circRNAs)是由稱為外顯子反剪接的過程產生的共價閉合RNA分子,與信使RNA相比,缺乏聚腺苷酸化的尾巴[13]。circRNA在真核生物中含量很高,其中許多是進化保守的[14]。CircRNA通常被歸類為非編碼RNA(ncRNA),盡管一些circRNA具有蛋白質編碼潛力[15-16],是由于circRNA具有獨特的共價閉合結構,其中的開放閱讀框在剪接位點上循環,甚至超過其長度,所以可以產生長>100個氨基酸的蛋白質[17-18]。CircRNA由于其獨特的結構和其他特性而參與各種生物過程[19]。CircRNA最突出的功能是充當miRNA海綿的能力,另外還參與轉錄調控或剪接、蛋白質的翻譯,并且還能與RNA結合蛋白相互作用。CircRNA已經被證明它們調節疾病的發展和發生[20-22],最近的證據表明,circRNA的異常表達幾乎發生在所有癌癥類型中,并且在癌癥發病機制中起著不可或缺的作用,無論是作為促癌基因還是腫瘤抑制因子[23]。例如,zhou等[24]發現Circ-MBOAT2可以通過調控胰腺癌中miR-433-3p/GOT1軸促進腫瘤進展和谷氨酰胺分解代謝,liu等[25]探究出circ-BNC2(hsa_circ_0008732)通過調控microRNA-223-3p/ FBXW7軸抑制卵巢癌的進展,這兩項研究都是針對circRNA與miRNA結合從而通過ceRNA機制影響腫瘤的發生發展。另外Feng等[26]探究出circ-HuR與CCHC型鋅指核酸結合蛋白(CNBP)相互作用,隨后抑制其與HuR啟動子的結合,導致HuR下調和腫瘤進展的抑制,wang等[27]的研究表明hsa_circ_0068631的上調可以通過與RNA結合蛋白EIF4A3結合來維持c-Myc mRNA的穩定性,從而促進BC的進展。

越來越多的研究表明,癌癥患者及其相應健康對照組之間circRNA的表達水平及其模式存在顯著差異,這表明人類中的各種circRNA分子可能代表監測癌癥診斷和進展的新型生物標志物[28]。隨著RNA測序技術和現代生物信息學的快速發展,人們對于癌癥中表達量與正常組織有顯著差異的circrna研究更加深入,越來越多參與癌癥進程的circRNA被鑒定出來,現在人們對于乳腺癌中circrna的探究也引入了大量的生物信息學手段。Li等[29]通過從基因表達綜合數據庫中下載了微陣列數據集GSE101123,然后分析了BC組織中與鄰近組織中差異表達的circrna,我們證明了circ_0000514在BC組織中上調,circ_0000514敲低可以抑制BC細胞的增殖、遷移和侵襲;kang等[30]通過分析數據集GSE101123發現hsa_circ_0000518在BC組織和細胞中異常上調,并通過實驗證明了circ_0000518在BC中具有致癌性,并通過miR-1225-3p/SOX4軸起作用;zhang等[31]通過分析微陣列數據集GSE111504發現與癌旁對照組相比,hsa_circ_0000129在乳腺癌組織中的表達水平顯著提高,通過實驗hsa_circ_0000129過表達顯著增加了細胞增殖,遷移和集落形成,hsa_circ_0000129的致癌分子機制可能與乳腺癌中EZH2表達上調有關。

本研究通過對于數據集GSE182471和GSE165884進行研究發現hsa_circ_0000741在兩個數據集中均呈現出在癌組織的表達量比相應癌旁組織高的趨勢,目前并沒有相關文獻對其研究,接下來在提取正常細胞株與癌細胞株對比后發現其在細胞中也符合該趨勢,通過敲減hsa_circ_0000741后通過集落、CCK-8、劃痕和侵襲實驗發現敲減hsa_circ_0000741可以抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲,hsa_circ_0000741在乳腺癌中可能起到促癌機制,對于hsa_circ_0000741的促癌機制,通過對hsa_circ_0000741下游基因預測發現hsa-miR-379-5p與hsa_circ_0000741有結合位點,并且hsa-miR-379-5p在乳腺癌中呈現顯著下降趨勢,對其進行生存分析后發現hsa-miR-379-5p高表達有利于患者預后,由此推斷hsa-miR-379-5p可能與hsa_circ_0000741存在海綿作用,為hsa_circ_0000741的下一步研究提供思路。