白藜蘆醇對ox-LDL誘導的內皮細胞鐵死亡影響

游福蓉,杜占慧,宗麗娟,王勤拯,張成,邢泉生

(青島大學附屬婦女兒童醫院,山東 青島 266034 1 心臟中心; 2 普外科)

動脈粥樣硬化(AS)是以脂質蓄積和炎癥細胞浸潤為主要特征的慢性炎癥性過程,是冠心病、心肌梗死、腦卒中等眾多心腦血管事件的病理基礎[1-3]。AS發病機制復雜,與多種因素密切相關,其中內皮細胞功能障礙是AS發生發展的始動環節[4]。內皮細胞功能障礙有利于氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)浸潤至內皮下層,同時選擇性招募單核細胞進入內皮下層轉變為巨噬細胞,通過吞噬經理化修飾的脂蛋白形成泡沫細胞引發局部炎癥反應,從而誘導AS的發生發展[3,5]。鐵死亡是近年發現的一種鐵依賴的新型細胞死亡方式,其特征是鐵依賴的活性氧(ROS)和脂質過氧化物的蓄積、谷胱甘肽(GSH)的耗竭以及谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)的失活等[1-2]。多項研究結果表明,鐵死亡是內皮細胞功能障礙的重要原因,在推動AS進展中發揮了重要作用[3-4]。白藜蘆醇為一種天然植物多酚,主要存在于葡萄、花生、虎杖、大豆等多種植物中,具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、延緩衰老等功效[6-7]。近年來研究發現,白藜蘆醇可通過調節血脂水平、抗血小板聚集、抗炎、抑制低密度脂蛋白氧化修飾、抑制斑塊內新生血管等作用發揮抗AS作用[8-10]。但有關白藜蘆醇對血管內皮細胞鐵死亡的影響尚未見報道。因此,本研究利用鐵死亡誘導劑ox-LDL建立人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)鐵死亡模型,探討白藜蘆醇對血管內皮細胞鐵死亡的影響及機制,從而為明確中醫藥治療AS疾病作用機制提供新的科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

HUVECs購自武漢普諾賽生命科技有限公司;內皮細胞培養液購自美國Sciencell公司;ox-LDL購自美國默克公司;白藜蘆醇,分子式為C14H12O3,分子量228.24,純度99.94%,購自美國MedChemExpress公司;ROS檢測試劑盒購自中國白鯊生物有限公司;亞鐵離子(Fe2+)檢測試劑盒購自中國賽默飛世爾公司;GSH及丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;CCK-8溶液購自武漢Proteintech公司;兔抗GPX4以及鼠抗β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體購自英國Abcam公司;兔抗鐵蛋白重鏈(FTH1)單克隆抗體購自Abmart公司;兔抗溶質載體家族7成員11(SLC7A11)單克隆抗體、山羊抗兔lgG-HRP及山羊抗鼠lgG-HRP二抗購自美國Proteintech公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養及分組 HUVECs置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2培養箱中,用內皮細胞培養液培養。將正常的HUVECs隨機分為對照組(A組)、ox-LDL組(B組)及白藜蘆醇低、中、高劑量組(C、D、E組)。A組在正常生長條件下培養,B組加入含有100 mg/L ox-LDL的內皮細胞培養液培養24 h,C、D、E組分別用白藜蘆醇5、10、20 μmol/L預處理4 h后,更換為含有100 mg/L ox-LDL的內皮細胞培養液培養24 h。

1.2.2CCK-8法檢測細胞存活率 取對數生長期HUVECs,以每孔5 000個接種于96孔板中,待細胞貼壁、按照實驗分組加入相應藥物處理后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,37 ℃孵育2 h,應用酶標儀在450 nm波長下檢測各孔的光密度(OD)值。然后計算細胞存活率,細胞存活率=[(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。每組設4個復孔,實驗獨立重復3次。

1.2.3細胞中Fe2+、ROS、MDA和GSH含量檢測將HUVECs按每孔2×105個接種于6孔板內,在37 ℃、含體積分數0.05 CO2培養箱中培養24 h后,按照實驗分組加入相應藥物進行處理。收集各組細胞,使用Fe2+、ROS、GSH、MDA檢測試劑盒測定細胞內Fe2+、ROS、GSH、MDA含量,實驗步驟嚴格按照說明書進行。每組設3個復孔,實驗獨立重復3次。

1.2.4免疫印跡法檢測細胞內GPX4、SLC7A11和FTH1蛋白表達 將HUVECs接種于6孔板,按照實驗分組加入相應藥物處理。收集各組細胞并提取總蛋白,進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳反應后,轉膜、封閉,加入一抗(β-actin、GPX4、FTH1和SLC7A11,以1∶1 000抗體稀釋液稀釋)4 ℃孵育過夜,加入羊抗兔二抗(以1∶5 000抗體稀釋液稀釋)和羊抗鼠二抗(以1∶10 000抗體稀釋液稀釋)室溫孵育1 h,洗去二抗,用ECL試劑盒顯色,在凝膠成像儀上顯影并拍照,用Image J軟件分析條帶灰度值。結果以目的蛋白與β-actin灰度值的比值表示。實驗獨立重復3次。

1.2.5免疫熒光法檢測細胞內GPX4、SLC7A11和FTH1表達 將HUVECs按每孔2×103個接種于24孔板內,在37 ℃、含體積分數0.05 CO2培養箱中培養24 h后,按實驗分組加入相應藥物處理。用40 g/L多聚甲醛室溫固定15 min,PBS浸洗,5 g/L Triton X-100透膜15 min,50 g/L BSA封閉1 h,去除封閉液,加入GPX4(應用1∶200抗體稀釋液稀釋)、SLC7A11(應用1∶200抗體稀釋液稀釋)以及FTH1(以1∶100抗體稀釋液稀釋)一抗4 ℃孵育過夜。用PBS洗凈一抗后,加入熒光標記的羊抗兔二抗(以1∶200抗體稀釋液稀釋)室溫避光孵育1 h。用PBS洗凈二抗后,以DAPI染核10 min,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片。熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。應用Image J軟件分析記錄每張圖片的平均熒光強度。實驗獨立重復3次。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 ox-LDL和白藜蘆醇對HUVECs存活率影響

CCK-8實驗結果顯示,ox-LDL濃度為50、100、150、200 mg/L逐漸升高時,HUVECs存活率逐漸降低。當ox-LDL濃度為100 mg/L時,與對照相比,細胞存活率為54.30%,差異具有統計學意義(F=655.08,P<0.01)。因此,為保證有足夠活力的細胞進行后續實驗,本研究選擇100 mg/L ox-LDL干預24 h作為誘導細胞鐵死亡的條件。見圖1。與對照相比,5、10、20 μmol/L濃度的白藜蘆醇對細胞存活率無明顯影響(P>0.05),說明本實驗中所用不同劑量的白藜蘆醇對HUVECs無損傷作用。見圖2。

注:n=4,*P<0.01。

注:n=4,ns表示P>0.05。

2.2 白藜蘆醇對ox-LDL誘導的HUVECs存活率的影響

CCK-8實驗結果顯示,各組HUVECs存活率差異具有統計學意義(F=200.00,P<0.01)。B組細胞存活率較A組顯著降低(P<0.01);而經低、中、高劑量白藜蘆醇預處理可減輕ox-LDL誘導的HUVECs損傷,并呈劑量依賴性,與B組比較,C、D、E組細胞存活率顯著升高,差異具有統計學意義(P<0.01)。見圖3。

注:n=4;與A組相比,*P<0.01;與B組相比,#P<0.01。

2.3 白藜蘆醇對ox-LDL誘導HUVECs中ROS、MDA、GSH和Fe2+含量的影響

各組HUVECs中ROS、MDA、GSH和Fe2+含量比較,差異均有統計學意義(F=30.26～415.07,P<0.05)。與A組相比,B組HUVECs中ROS、MDA和Fe2+含量顯著增加,而GSH含量顯著降低(P<0.05);與B組相比較,C、D、E組HUVECs中ROS、MDA和Fe2+含量顯著降低,GSH含量顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組HUVECs中GSH、MDA、Fe2+和ROS含量的比較

2.4 白藜蘆醇對ox-LDL誘導HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11表達的影響

免疫印跡法檢測結果顯示,各組HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11蛋白表達比較,差異均具有統計學意義(F=58.62～88.92,P<0.05)。與A組相比較,B組HUVECs中GPX4、FTH1以及SLC7A11蛋白的表達顯著降低(P<0.05);與B組相比較,C、D、E組HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11蛋白的表達顯著增加(P<0.05)。見圖4和表2。

表2 各組HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11蛋白表達的比較

圖4 免疫印跡法檢測各組細胞中GPX4、FTH1和SLC7A11蛋白表達

免疫熒光法檢測結果顯示,各組HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11表達比較,差異均有統計學意義(F=62.18～722.16,P<0.05)。與A組相比,B組HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11蛋白表達顯著降低(P<0.05);與B組相比,E組HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11表達顯著增加(P<0.05)。見圖5和表3。

表3 各組HUVECs中GPX4、FTH1和SLC7A11表達的比較

A、B、C分別示A組、B組和E組GPX4的表達,綠色為GPX4染色,藍色為DAPI熒光染色下的細胞核;D、E、F分別示A組、B組和E組FTH1的表達,綠色為FTH1染色,藍色為DAPI熒光染色下的細胞核;G、H、I分別示A組、B組和E組SLC7A11的表達,綠色為SLC7A11染色,藍色為DAPI熒光染色下的細胞核。白色箭頭示目的蛋白表達區域。免疫熒光染色,100倍。

3 討 論

隨著社會老齡化加重及居民不健康生活方式增加,我國AS誘發的多種心血管疾病發病率、死亡率持續升高。AS發病機制復雜,主要與內皮細胞功能障礙、炎癥反應、氧化應激、血栓形成及脂質浸潤等密切相關[1-3]。目前逆轉AS嚴重后果的療法仍然有限。白藜蘆醇作為多酚類植物化合物的代表,可以通過調節脂質代謝、抑制ROS生成、維持內皮功能穩定等來發揮抗AS作用。但白藜蘆醇的具體作用機制至今尚未完全闡明。因此,本研究從鐵死亡的角度來探討白藜蘆醇對AS的作用及其潛在機制。有研究表明,血管內皮細胞用ox-LDL處理后表現出鐵死亡的特征,使用鐵死亡抑制劑則明顯逆轉了細胞的死亡[11]。因此,本研究使用ox-LDL誘導HUVECs發生鐵死亡。本文結果顯示,ox-LDL處理后內皮細胞活力明顯下降,出現鐵死亡;經白藜蘆醇(5、10、20 μmol/L)預處理可以降低細胞鐵死亡,減少ROS和MDA產生,顯著提高內皮細胞活力,且該效應隨著白藜蘆醇劑量增加而增強。這表明白藜蘆醇對ox-LDL誘導的鐵死亡有拮抗作用,從而可以延緩AS病程進展。

內皮細胞損傷是AS早期病理改變。有研究表明,鐵死亡通過多種生理機制參與AS的內皮細胞損傷,如鐵過載可以促進ROS產生并且激活局部腎素-血管緊張素系統,誘導血管內皮細胞中氧化應激水平升高,導致內皮損傷,增加AS斑塊的不穩定性[12];鐵死亡抑制劑通過減輕鐵死亡引起的內皮細胞氧化損傷而發揮抗AS作用[3]。由此可見,鐵死亡已成為調節內皮細胞功能的關鍵角色。

鐵死亡是一種鐵依賴的可調節的氧化性細胞死亡方式[13],在生物化學方面表現為細胞內抗氧化系統GSH/GPX4失活,過量的Fe2+通過芬頓反應產生大量的ROS,與細胞膜上的多不飽和脂肪酸發生氧化應激反應,導致脂質過氧化物積累,使MDA生成增多。本研究經ox-LDL處理的HUVECs中,Fe2+、ROS和MDA含量增加,FTH1和GSH水平下降;而白藜蘆醇干預可降低細胞內Fe2+、ROS和MDA含量,提高FTH1和GSH的水平。MDA是ROS介導脂質過氧化生成的一種不飽和醛類物質,由于它與親核化合物的反應性以及在沒有活性的情況下,能使蛋白質和DNA發生反應,生成特殊的加合物而產生細胞毒性[14]。相關研究表明,MDA可以促進巨噬細胞產生炎癥因子,從而加重血管周圍的炎癥反應并損傷血管內皮細胞,破壞內皮結構完整性并造成內皮功能障礙,促進AS的發生[15]。因此,MDA被認為是造成血管功能障礙的介質之一。GSH是體內的非酶抗氧化劑,可以作為硒依賴性GPX4的輔因子和底物來減少脂質過氧化物,在降低氧化應激水平中起著關鍵作用[16-19]。由此可見,白藜蘆醇通過提高HUVECs抗氧化能力和降低MDA含量來減輕ox-LDL誘導產生的細胞損傷。鐵蛋白為細胞提供了一種以氧化還原非活性形式鎖住過量鐵的手段,以防止鐵介導的細胞和組織損傷。鐵蛋白由鐵蛋白輕鏈和FTH1構成,是一種儲鐵蛋白復合體,可調控儲存的鐵離子。FTH1在鐵蛋白結構中起到關鍵作用,也是鐵死亡發生的標志性蛋白,可催化Fe2+氧化發揮儲鐵功能進而減少細胞內Fe2+。FTH1水平降低導致體內Fe2+水平升高,過量的Fe2+會引起脂質代謝紊亂,導致ROS水平升高,促進鐵死亡發生[18,20]。本研究結果表明,白藜蘆醇能夠通過調節氧化應激清除過量的Fe2+,抑制鐵死亡的發生。

GPX4作為細胞內唯一可直接降低磷脂過氧化的抗氧化酶,是鐵死亡的重要調節因子[21]。GPX4以GSH為還原劑,催化過氧化物的過氧鍵轉變為羥基,將過氧化物轉變為類脂醇,使其失去氧化活性,進而抑制鐵死亡[16,22]。GSH和GXP4被認為是細胞發生鐵死亡的標志物[23-24]。本研究結果顯示,ox-LDL組HUVECs存活率降低,GSH含量降低,GPX4蛋白的表達下調;給予白藜蘆醇預處理后,細胞存活率升高,GSH含量升高,GPX4蛋白表達上調,提示白藜蘆醇可以減輕HUVECs鐵死亡。

SLC7A11是胱氨酸/谷氨酸交換轉運體(System Xc-)的底物特異性亞基,在抗氧化劑GSH的生物合成中起著核心作用。SLC7A11的活性被抑制會導致GSH合成減少,引發氧化損傷,最終導致鐵死亡的發生。研究表明,System Xc-和GPX4的活性狀態是調節鐵死亡的關鍵機制[25]。有文獻報道,高良姜素通過激活SLC7A11/GPX4軸抑制鐵死亡,從而對腦缺血再灌注后沙鼠的海馬神經元發揮保護作用;淫羊藿苷通過調節SLC7A11/GPX4信號通路抑制高糖誘導的小膠質細胞鐵死亡;鹿紅方通過SLC7A11/GPX4信號通路減輕心肌缺血再灌注損傷引起的心肌細胞鐵死亡[26-33]。本研究結果顯示,ox-LDL組HUVECs中,GPX4和SLC7A11蛋白的表達顯著降低;而給予白藜蘆醇預處理后,細胞中GPX4和SLC7A11蛋白的表達顯著升高。由此推測,白藜蘆醇可能通過激活SLC7A11/GPX4軸來對抗ox-LDL誘導的鐵死亡。

綜上所述,調控鐵死亡可能為白藜蘆醇治療AS的重要機制,本研究結果為深入挖掘中醫藥治療AS疾病作用機制提供了新思路。但本研究僅在細胞層面初步探討了白藜蘆醇對ox-LDL誘導鐵死亡的可能作用機制,存在一定的局限性,后續將深入研究白藜蘆醇調節鐵死亡的直接機制和作用靶點。