Tmod1過表達對大鼠血管平滑肌細胞遷移和侵襲的影響

馬 杉，謝利德*，姚偉娟

（1.承德醫學院基礎醫學院，河北承德 067000；2.北京大學醫學部基礎醫學院）

血管再狹窄是冠狀動脈血管成形術后的常見并發癥，嚴重影響著人類生活與身體健康，血管再狹窄由多種原因造成，其中平滑肌細胞異常增殖和遷移所造成的血管內膜異常增生是動脈術后再狹窄發生的危險因素[1]。當平滑肌細胞受到外界損傷或者受到某種因子的影響時，會由分化狀態轉為去分化狀態，其遷移能力和增殖能力增加，收縮力降低，因此平滑肌細胞的異常遷移和增生在心血管疾病中帶來很大的影響。有研究發現，肌動蛋白細胞骨架的破壞介導器官培養中血管平滑肌細胞早期表型轉換中應力纖維的丟失，平滑肌細胞轉為去分化狀態，肌動蛋白解聚增加[2]。原肌球蛋白調節蛋白1（Tropomodulin1，Tmod1）是肌動蛋白微絲的一種蓋帽蛋白，在細胞中表達量的改變會直接影響肌動蛋白微絲的組裝，參與肌動蛋白的延伸和解聚，從而影響著細胞骨架的結構。前期研究表明，Tmod1也表達在血管平滑肌細胞中[3]，然而Tmod1對平滑肌細胞的增殖、遷移和侵襲能力的影響目前尚不明確。因此，本研究旨在通過在大鼠胸主動脈平滑肌細胞體外感染腺病毒，使Tmod1過表達后檢測細胞遷移和侵襲能力的變化，從而探討Tmod1在血管再狹窄中的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器設備

雄性SD大鼠(150～180 g左右)購自北京大學醫學部實驗動物中心；細胞DMEM低糖培養基（中科邁晨公司）；胎牛血清（Biological Indutries，Israel）；鼠抗GAPDH（Santa Cruz Biotech，USA)；兔抗Tmod1（京天成，北京）；山羊抗兔、鼠二抗（中杉金橋，北京）；Transwell小室（Falcon，DE）；BCA蛋白定量（普利萊，北京）；酶標儀（Bio-Rad，USA)；細胞培養箱(Sanyo，Janpan)；PCR擴增儀（Bio-Rad，CA，USA)。

1.2 細胞提取及培養

脫頸處死SD大鼠，用75%的酒精噴灑大鼠頸部胸部皮膚，依次剪開胸部的皮膚和肌肉；取出胸主動脈放入滅菌的PBS中；在超凈臺中洗血管，去除血管外組織；將血管放入二型膠原酶中消化30 min，輕刮法去除內膜，剝離外膜；將剝離的中膜置于10% FBS的低糖DMEM培養基中，放入細胞培養箱過夜；第二天，將血管中膜放入消化液中消化90 min，吹打分離，再消化30 min；加入20%胎牛血清的低糖DMEM培養基10 mL以達到停止消化的目的，1500 rpm，離心6 min；棄上清，加入4 mL的10%胎牛血清的低糖培養基重懸，6 cm培養皿進行培養，用以進行后續實驗。

1.3 腺病毒感染

六孔板中分別加1 mL含有腺病毒的培養基，放回細胞培養箱。12 h后，再加入1 mL含10%胎牛血清的DMEM培養基。培養48 h后，可依據實驗目的提取蛋白或RNA。

1.4 Western blot

向六孔板培養皿中加入80 uL裂解液，提取總蛋白，BCA法進行蛋白定量，加5×Loading buffer，95℃水浴鍋加熱10 min。轉膜，用含有5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗過夜[Tmod1（1:500，北京京天成生物有限公司）；GAPDH（1:10000，proteintech）]，第二天TBST洗膜3次，隨后二抗孵育，室溫孵育1 h，洗膜3次后進行ECL顯影。

1.5 細胞RNA的提取

向六孔板培養皿中加入1 mL的TRIP RNA提取液，于樣品加200 μL的氯仿，充分混合，冰中放15 min，10000 r/min離心15 min，將上清溶液吸至新的EP管中，加入等體積的異丙醇，-20℃過夜，次日進行離心，可以觀察到白色沉淀，吸棄上清；75%乙醇洗RNA，洗3次，離心10 min，棄上清后，置于室溫干燥，加入20μL DEPC水，55℃水浴鍋中助溶2 min，測濃度。之后用以擴增及實時定量PCR。

1.6 細胞劃痕實驗

六孔板中鋪2×105細胞，感染腺病毒48 h后，在含10%FBS的培養基中培養且生長密度大于90%，用200 μL槍頭垂直于培養板底部在每孔中間劃直線;棄舊的培養基，PBS緩沖液重復洗3次之后加無血清的培養基，培養0、12、24、36 h時在顯微鏡下觀察并測量劃痕間隙的寬度。

1.7 Transwell實驗

感染后48 h，加入胰蛋白酶消化，細胞培養箱中消化2 min，加入含10% FBS的培養基來達到停止消化的目的，吹打混合均勻，取100 μL細胞懸液加到Transwell上室；再在下室加1 mL含20%胎牛血清的培養液，以不同血清濃度做趨化；放回CO2培養箱，培養48 h。拿出小室，吸出小室內舊的培養基，用PBS輕輕洗2次，用4%多聚甲醇來固定細胞20 min，吸出固定液，用PBS洗2次，之后用Giemsa染液染色20 min；用PBS輕輕洗棄染色液，棉簽輕輕擦凈表面上的細胞，靜置干燥，于顯微鏡下（100倍）觀察并拍攝，隨機選取5個鏡下視野且計數細胞，計算出5個視野內的細胞平均值。

1.8 統計學處理

實驗數據均以均值±標準差表示，使用統計學軟件SPSS 19.0對所得數據進行處理，所有組間兩兩進行比較，采用t檢驗方法，P＜0.05時，即表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠胸主動脈平滑肌細胞的鑒定

為了鑒定所培養的大鼠胸主動脈細胞為平滑肌細胞，我們使用了收縮型平滑肌細胞標志蛋白平滑肌22α（smooth muscle 22 alpha，SM22α）的抗體對細胞進行了免疫熒光染色。結果顯示（圖1），DAPI標記的所有細胞核呈現橢圓形。視野中幾乎所有的細胞均為SM22α陽性細胞，在平滑肌細胞的胞質中與細胞長軸平行，細絲狀形狀。這提示我們所分離的大鼠主動脈細胞為平滑肌細胞，且純度較高。

圖1 免疫熒光SM22α染色鑒定平滑肌細胞

2.2 Tmod1過表達的驗證

我們首先在SD大鼠胸主動脈原代平滑肌細胞中感染Ad-Null、Ad-Tmod1腺病毒，通過RT-qPCR及Western blot來檢測Tmod1的蛋白表達情況及mRNA的表達情況。結果發現，當腺病毒濃度為40MOI時，可使Tmod1的蛋白水平(圖2A)及mRNA水平增加（圖2B）。

圖2 Tmod1過表達驗證

2.3 過表達Tmod1后平滑肌細胞遷移情況

大鼠胸主動脈平滑肌細胞感染腺病毒48 h后，進行劃痕，分別在0、12、24、36 h拍照記錄劃痕愈合的情況。結果顯示（圖3），與陰性Ad-Null組比較，過表達Tmod1后細胞劃痕愈合面積增加，表示過表達Tmod1組遷移能力明顯上升，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3 平滑肌細胞過表達對照腺病毒和Tmod1后各組細胞劃痕愈合情況

2.4 Tmod1過表達后細胞侵襲能力的情況

大鼠胸主動脈平滑肌細胞感染腺病毒48 h后，消化細胞，接種在Transwell小室中培養，48 h后進行固定染色拍照，結果顯示（圖4），與對照腺病毒組相比，過表達Tmod1組的細胞侵襲能力上調，差異有統計學意義（P<0.05）。

圖4 各組細胞Transwell侵襲實驗結果

2.5 Tmod1調節平滑肌細胞中MMP15的表達

采用RT-qPCR的方法檢測過表達Tmod1與對照腺病毒處理的平滑肌細胞中檢測MMP15的表達水平變化，結果顯示，過表達Tmod1后的平滑肌細胞與對照腺病毒平滑肌細胞相比，MMP15的表達量明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05）。

圖5 MMP15的mRNA的表達變化

3 討論

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是由多種因素參與共同發揮作用而導致的慢性炎性反應，血管平滑肌細胞遷移是AS、冠狀動脈血管成形術后再狹窄等的重要病理基礎，許多分子及藥物已經被證明可以通過調節平滑肌細胞的遷移和侵襲，進而抑制平滑肌細胞內膜的生成，進而減慢動脈粥樣硬化疾病的發生發展[4,5]，因此研究平滑肌細胞遷移和侵襲的分子機制對于緩解動脈粥樣硬化、高血壓的治療等至關重要。

細胞骨架由微管、肌動蛋白微絲和中間纖維組成，G-肌動蛋白單體（含ATP）可聚合為呈纖維狀的F-肌動蛋白。研究發現，Tmod1的耗盡會導致肌動蛋白-肌鈣蛋白絲的拆卸，應力纖維的丟失以及細胞性形態的嚴重缺陷[6]。在本研究中，我們發現Tmod1的表達水平與平滑肌細胞的遷移與侵襲能力正相關，對過表達Tmod1與對照腺病毒感染的平滑肌細胞進行RNAseq分析，在所獲得的差異基因中，我們發現了基質金屬蛋白酶家族中的MMP15。MMPs家族由于可以直接降解癌癥細胞外膜基質中的蛋白成分，進而有效摧毀了癌癥細胞對外入侵的防御屏障，所以它在阻止癌癥細胞侵襲和轉移過程中也發揮出了其重大的影響作用[7]，先前的文章中已經詳細研究分析了MMP15家族可能是在阻止癌癥細胞的入侵過程中發揮關鍵性作用[8]，所以認為MMP15可能是過表達Tmod1后促進細胞遷移的潛在靶點。我們的實驗表明，在平滑肌細胞中過表達Tmod1后，MMP15的表達是上升的。

綜上所述，過表達Tmod1可以促進平滑肌細胞的遷移和侵襲，是調節平滑肌細胞遷移的重要因子，并且可能是通過上調MMP15來實現的，接下來我們將會進一步研究揭示Tmod1是如何調節MMP15的表達從而影響平滑肌細胞遷移的。