基于數據挖掘及網絡藥理學分析新安醫家治療哮喘的用藥規律及作用機制

王 婷 ，汪 洋 ，董 鵬，尚莉麗

（1.安徽中醫藥大學 研究生院，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院 兒科，安徽 合肥 230031）

新安醫學以古徽州文化為土壤，以儒學、新安理學、新安樸學等傳統文化為源泉，在“不為良相，即為良醫”的思想引導下誕生了諸多名醫大家，創造了大量具有科學價值的學術思想，編纂了諸多醫學專著，為后世醫家所延用。哮喘為臨床難治病之一，中醫屬“哮證”“喘證”的范疇，主要表現為反復咳喘、胸悶、呼吸困難等。本研究從新安醫家著作入手，通過數據挖掘技術對與哮喘相關處方進行系統的梳理并發掘核心處方，利用網絡藥理學對核心處方進行分析，探索新安醫家治療哮喘的用藥規律及潛在作用機制，以期為臨床治療提供參考。

1 一般資料

1.1 資料來源

數據源自24 本新安醫學專著，具體如下：《石山醫案》《醫方考》《名醫類案》《證治方藥》《醫宗金鑒》《醫學心悟》《臨證指南醫案》《不居集》《生生子醫案》《薛生白醫案》《程杏軒醫案》《醫燈續焰》《葉天士醫案》《葉氏醫案存真》《眉壽堂方案選存》《葉氏晚年醫案存真》《續名醫類案》《松崖醫徑》《丹臺玉案》《王任之醫案》《王仲奇醫案》《醫驗錄》《程茂先醫案》《程門雪醫案》。

1.2 檢索策略

針對哮喘病因病機、常見臨床癥狀以及相關體征，以“哮病”“咳喘”“喘息”“喘逆”“喘鳴”“哮吼”“呷嗽”“上氣”“哽氣”“水雞聲”為關鍵詞進行檢索。

1.3 納入標準

（1）新安醫家著作；（2）具有完整藥物組成者；（3）各種劑型均可納入；（4）取首診及二診、三診處方；（5）同一處方只納入一次；（6）處方相似但藥物個數相差≥3味者均納入，不足者取藥物多者納入。

1.4 排除標準

（1）無具體藥物組成者；（2）藥物組成＜2 味者；（3）合并其他疾病者；（4）處方療效不明確或無效者；（5）處方重復者。

1.5 數據錄入及預處理

本研究采用三人錄入模式，以2020 年版《中國藥典》[1]、《中醫藥大辭典》[2]、《中華本草》[3]為參考，對中藥進行規范化命名。當炮制方法、用藥部位等不同時，對功效影響較小者應規范為同一名稱（如：“炙甘草”“炙麻黃”統一命名為“甘草”“麻黃”），差異較大者則分別錄入（如：“生地”“熟地”分別命名為“地黃”“熟地黃”）。兩人將規范后的數據錄入，建立新安醫學哮喘數據庫，另一人進行核對，確保數據的真實性與準確性。

1.6 數據挖掘分析

（1）頻數統計：利用Excel 2016 軟件對中藥頻數、性味歸經、用藥類別進行統計分析。（2）關聯規則分析：利用IBM SPSS Modeler 18.0 軟件，選取Apriori 算法，進行關聯規則分析，獲得新安醫家治療哮喘的核心藥對。（3）聚類分析：采用SPSS 23.0 軟件對數據進行聚類分析，發掘新安醫家治療哮喘的藥物組合。（4）復雜網絡可視化分析：利用Cytoscape 3.9.1軟件對關聯規則分析所獲得的鏈接進行復雜網絡分析，發掘核心處方。

1.7 網絡藥理學分析

（1）有效成分篩選：通過TCMSP 數據庫(http: //tcmspw.com / tcmsp.Php)檢索核心處方藥物，按照口服利用度（OB）、類藥性（DL）篩選出核心處方有效成分。（2）藥物靶點預測：通過TCMSP 數據庫獲取活性成分對應靶點。未找到明確靶點者，使用Pubchem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）獲得簡化分子線性輸入規范并將其輸入Swiss Target 數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch）獲得相應靶點，并將其輸入Uniprot 數據庫（https://www.uniprot.org），選取“人類”為研究對象，進行標準化命名，合并去重后獲得核心處方總靶點。（3）疾病靶點預測：以“asthma”為關鍵詞利用OMIM 數據庫（https://omim.org）、Genecard數據庫（https://www.genecards.org）、disGENET 數據庫（https://www.disgenet.org）進行檢索，將所有數據庫所得疾病靶點整合去重，獲得哮喘相關基因。（4）哮喘-藥物交集靶點：將疾病、藥物靶點依次輸入Venny 2.1.0網站（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）獲取交集靶點。（5）PPI 分析：將交集靶點輸入STRING 數據庫（https://cn.string-db.org),獲得哮喘-藥物PPI 關系，通過Cytoscape 3.9.1 進行可視化升級并篩選出核心靶點。（6）功能富集分析：將交集靶點輸入DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov）進行富集分析，并利用微生信網站（http://www.bioinformatics.com.cn/）進行可視化展示。

2 結果

2.1 新安醫家治療哮喘用藥規律分析

2.1.1 中藥頻次分析 在237 條處方中共出現藥物220 種，總用藥頻次達1 919 次，使用最多者為甘草，達101 次，使用頻率為5.26%（頻率 = 頻次/總用藥頻數），置信度達42.62%（置信度=頻次/處方數），使用頻次前30 名的藥物情況見表1。

表1 藥物頻數表Tab.1 Drug frequency table

2.1.2 藥性分析 在所涉及220 味藥中藥性以溫、寒、平性藥多見，分別為65、50、40 次，約占所有藥物的29.55%、22.73%、18.18%。見表2。

表2 中藥藥性統計表Tab.2 Statistical table of of drug property distribution of Chinese medicine

2.1.3 藥味分析 在此220 味中藥中藥味以甘、辛、苦為主，分別出現96、89、80 次，約占從總藥味頻次的27.99%、25.95%、23.32%。見表3。

表3 中藥藥味統計表Tab.3 Statistical table of Chinese medicine taste distribution

2.1.4 藥物歸經分析 該220 味中藥以歸肺經者最多，共使用了112 次，其次為脾經、胃經，各使用了84、79 次。見圖1。

圖1 中藥歸經分布雷達圖Fig.1 Radar chart of meridian tropism distribution of traditional Chinese medicine

2.1.5 藥物類別分布 通過藥物類別分析可知，補虛藥數量最多，其次為清熱藥、止咳化痰平喘藥，分別占35、27 和27 味。見表4。

表4 中藥功效分類統計表Tab.4 Statistical table of efficacy classification of traditional Chinese medicine

2.1.6 關聯規則分析 將規范化處理后的數據整理成矩陣的形式，并輸入IBM SPSS Modeler 18.0 軟件，利用Aprior 算法創建關聯規則模型，當支持度≥10%、置信度≥70%[4]時，可得出二項關聯規則5 項。見表5。

表5 藥物二項關聯規則分布（支持度≥10%，置信度≥70%）Tab.5 Distribution of drug binomial association rules （support ≥10%,confidence ≥70%)

2.1.7 聚類分析 對規范化處理后的藥物，按使用頻次降序排列，將前30 味常用藥物輸入SPSS 23.0軟件，以歐式距離為距離類型，最長距離法為聚類方法進行聚類分析并繪制譜系圖，具體見圖2。結合中醫基礎及臨床使用情況，以距離17 為界獲得以下8個聚類組，分別為：C1: 款冬花、紫苑、百部、葶藶子、紫蘇子、薏苡仁；C2:苦杏仁、麻黃、干姜、桂枝；C3:半夏、橘紅；C4:人參、黃芪、五味子、麥冬；C5：白芍、當歸、白術、黃芩；C6:生姜、大棗、甘草；C7:陳皮、紫蘇葉、桔梗；C8:桑白皮、浙貝母。

圖2 高頻藥物聚類分析圖Fig.2 High-frequency drug clustering analysis diagram

2.1.8 復雜網絡可視化分析 將關聯規則分析所得出的鏈接數據導入Cytoscape 3.9.1 軟件進行藥物網絡可視化分析，其中，節點即藥物，節點越大、顏色越深則該藥物在本病的治療中越重要。線則為藥物與藥物之間的鏈接，連線越粗表示藥物間同時出現的概率越高。Degree 值為節點的度中心性，Degree 值越大，藥物與本病的關聯性越大。結果顯示，茯苓、甘草、苦杏仁、人參、五味子、半夏、紫蘇子、桑白皮、麻黃、生姜、陳皮等11 味藥節點最大、顏色最深、連線最多，與本病的關聯性最大，屬核心藥物，并視此為新安醫家治療哮喘的核心處方，見圖3。

2.2 核心處方治療哮喘作用機制分析

2.2.1 成分及靶點篩選 根據核心處方藥物分別輸入TCMSP 數據庫，當生物利用度(OB)≥30%，類藥性（DL）≥0.18 時[5]，獲得茯苓、苦杏仁、人參、五味子、半夏、紫蘇子、桑白皮、麻黃、陳皮、生姜、甘草的有效成分分別為15、19、22、21、13、16、32、23、10、5、92 個。合并去重后獲得總活性成分228 個。通過TCMSP、Swiss Target 數據庫，獲得活性成分對應靶點，輸入Uniprot 數據庫，以“人類”為研究對象進行標準化命名，合并去重后獲得到總靶點730 個。

2.2.2 疾病靶點預測 分別通過OMIM、GeneCard、Disgenet 數據庫，以“asthma”為關鍵詞進行檢索，分別獲得相關靶點44、7 896、2 096 個，按照Score ≥3 次中位數篩選后獲得疾病相關靶點1 089 個，并輸入Uniprot 數據庫進行標準化矯正。

2.2.3 哮喘-藥物交集靶點 將藥物及哮喘靶點分別輸入Venn 2.1.0 網站獲得交集靶點229 個，并繪制韋恩圖，見圖4。

圖4 哮喘-藥物交集基因Venn 圖Fig.4 Venn diagram of asthma-drug intersection gene

2.2.4 PPI 分析 將229 個交集靶點輸入STRING數據庫，獲得交集靶點的PPI 互作網絡，將其輸入Cytoscape 3.9.1 軟件進行可視化升級，見圖5。利用Cytoscape 軟件插件cytoHubba 利用MMC 算法對其進行拓撲分析，獲得相關性最高的10 個為核心基因，分別為：STAT3、TNF、IL-6、IL-1B、IL-10、CCL2、CXCL8、ICAM1、IL-4、IL-2，見圖6。

圖5 哮喘-藥物PPI 網絡圖Fig.5 Asthma-drug PPI network diagram

圖6 MCC 提取核心基因圖Fig.6 Core gene map extracted by MCC

2.2.5 功能富集分析 將哮喘-藥物交集靶點輸入DAVID 數據庫獲得GO 功能富集結果1 296 條（BP 1 018 個、CC 87 個、MF 191 個），KEGG 通路富集分析獲得通路171 條，按P 值排序，篩選前20 項輸入微生信平臺進行可視化展示，見圖7、8。其中，BP（生物學過程）有炎癥反應、脂多糖應答、藥物應答、胞漿鈣離子濃度的正調控、細胞衰老等，CC（細胞組分）有質膜、受體復合體、局部粘著斑激酶、神經元細胞體、胞液等，MF（分子功能）有酶結合、蛋白結合、轉錄因子結合、蛋白酪氨酸激酶活性、細胞因子活性等。KEGG 通路包括Th17 細胞分化途徑、IL-17 信號通路、鈣信號通路、TNF 信號通路、PI3K-Akt 信號通路等。

圖7 GO 功能富集分析柱狀圖Fig.7 Histogram of GO function enrichment analysis

圖8 KEGG 通路富集分析氣泡圖Fig.8 Bubble diagram for KEGG pathway enrichment analysis

3 討論

中醫學認為，哮喘的發生是內外因相互作用的結果，主要由外感六淫時邪、情志異常、嗜食甜酸咸腥、體虛勞倦等內外因素，觸動內伏之痰飲，相互搏結，壅滯氣道，肺失宣肅所致。認為哮喘病位總屬于肺，與五臟密切相關，藥物分析可知新安醫家治療哮喘多用補虛藥、清熱藥、化痰止咳平喘藥，藥性以溫性、寒性為主，藥味以甘、辛、苦為先，此多與哮喘發生之內外因以及病理因素相符合，體現了新安醫家標本兼治的學術思想。歸經分析得出，主要歸肺、脾、胃、腎，與哮喘的病位相合，肺屬金，脾屬土，咳喘日久，肺氣耗傷，子盜母氣，脾胃虛損。腎與脾，先后天相互資生，肺脾胃腎經藥物相互為用，體現了新安醫家培土生金、固本培元的學術思想。新安醫家認為，哮喘“內有壅塞之氣，外有非時之感，膈有膠固之痰”[6]，治療當注重調暢氣機，化痰祛瘀。半夏-橘紅為二陳湯之核心，為治痰之常用藥對；苦杏仁-紫苑開肺通腑，麻黃-苦杏仁宣降相宜，均有調暢氣機之功；杏仁-款冬花止咳化痰；薏苡仁-苦杏仁宣上利下，肺脾同調，行氣利水，從源頭抑制痰的產生。聚類分析主要將新安醫家治療哮喘用藥聚為8 類，聚一類、聚三類、聚七類、聚八類側重行氣止咳化痰，主要針對哮喘咳喘、痰多之外在表現。聚二類為臨床治療哮喘的常用方小青龍湯核心藥物，具有抗過敏、抗炎、止咳平喘之功[7]。聚四類為生脈散加黃芪，《醫學源啟》云：“麥門冬……治肺中伏火，脈氣欲絕。加五味子、人參二味為生脈散，補肺中元氣不足”[8]。黃芪具有補益肺脾之氣，固護肌表之功[9]，主要針對哮喘本虛之性。聚五類酸收相配，養血活血，主要針對哮喘氣滯日久化瘀之性。聚六類有佐使之功，擅助各類藥物調和脾胃、補益氣血、扶正祛邪[10]。以上均表明，新安醫家治療哮喘時注重對氣的調控，重視“痰”“瘀”在哮喘中的作用。

由復雜網絡可視化分析得出，新安醫家治療哮喘核心處方為：茯苓、甘草、苦杏仁、人參、五味子、半夏、紫蘇子、桑白皮、麻黃、生姜、陳皮。此方以華蓋散為依托，方中麻黃發汗散寒、宣肺化痰為君，臣以降氣止咳化痰之苦杏仁、紫蘇子，宣降得宜，共奏降氣止咳化痰之功，暗合哮喘痰飲內伏，肺氣上逆之病機，佐以茯苓健脾滲濕，生姜辛溫通陽、宣散痰濕，桑白皮瀉肺平喘、利水消腫，陳皮理氣健脾、半夏燥濕化痰，人參大補元氣、補益肺脾，氣順則痰自除，痰除則氣下，與哮喘“內有壅滯之氣，膈有膠固之痰”之特性相符。哮喘肺脾本虛，純用溫燥之品恐有耗氣傷津之虞，故以五味子上能斂肺氣，下能資腎陰，與人參合用，使氣陰兩復，肺潤津生，亦為佐藥。甘草益氣補中、化痰止咳、調和諸藥應為佐使。諸藥同用，升降相宜，散收有序，共奏健脾益氣、止咳化痰、行氣平喘之功。

西醫認為，哮喘是多種細胞、細胞因子以及細胞組分相互作用的結果[11]，由網絡藥理學結果可知，核心藥物對哮喘的作用是從多靶點、多路徑產生的，且多與氣道炎癥以及氣道重塑相關。IL-2、IL-4、IL-6、TNF、CCL2 為重要的促炎因子，通過破壞Th1/Th2 平衡、細胞與細胞間相互作用、介導單核細胞、巨噬細胞炎癥部位遷移等途徑誘發或加重氣道炎癥，與哮喘的嚴重程度成正相關[12-14]。而CCL2、IL-10、STAT3 具有減少促炎介質分泌、抑制自身免疫、介導白細胞向炎癥部位遷移等作用[15-16]，對哮喘氣道炎癥的發生具有保護作用。IL-1B、CXCL8、ICAM-1 參與嗜酸性粒細胞遷移、聚集、脫顆粒等過程，可促進哮喘氣道重塑的發生[17-19]，對哮喘患者肺功能產生不良影響。核心處方主要通過Th17 細胞分化途徑、鈣信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、PI3K-Akt 信號通路等多種路徑治療哮喘。IL-17 信號通路與Th17 細胞分化信號通路為上下游關系，現已證明Th17 細胞分化在哮喘的發病機制中占據重要地位[20]。氣管平滑肌收縮特性的變化和平滑肌質量增加的是導致氣道高反應性和重塑的主要因素[21]，而鈣離子信號是維持氣道平滑肌功能重要因素，在哮喘的治療中存在重要意義。TNF 信號通路與哮喘發病最重要的通路之一，可通過激活NF-κB、MAPK 信號通路發揮作用，參與哮喘氣道重塑、氣道高反應性以及慢性炎癥的各個過程[22]。PI3K-Akt 信號通路在炎癥募集、調節炎癥介質的表達以及慢性炎癥呼吸性疾病的氣道重塑、免疫細胞功能和皮質醇不敏感方面起著重要的作用[23]，是治療哮喘最經典的通路之一。

4 結論

新安醫家用藥多從炎癥反應、氣道重塑等角度治療哮喘，注重標本從治，尤為側重對氣的調控，強調治“痰”“瘀”的重要性，用藥針對性強，結合病因病機隨證輔以解表、補虛、行氣、化痰、活血之法，體現了新安醫家“標本兼顧”“培土生金”“固本培元”的學術思想，為臨床醫療提供了參考。