柱前衍生-高效液相色譜串聯高分辨質譜法檢測谷氨酸鈉注射液中谷氨酸鈉的含量

隋紅霞王培旭

(1天津市河西區東海街社區衛生服務中心,天津 300222;2煙臺山醫院藥劑科,煙臺 264000)

氨基酸是含有氨基和羧基的一類有機化合物的通稱,氨基酸的分析技術對蛋白質化學、生物化學和整個生命科學研究以及產品開發、質量控制和生產管理等具有重要意義[1-2]。一方面谷氨酸鈉注射液是一種用于治療代謝性酸中毒、電解質紊亂、肝性腦病的藥物,內含谷氨酸鈉,因其無發色基團且極性較大為高靈敏度和高選擇的分析帶巨大來挑戰[3-4]。另一方面,谷氨酸鈉含量的準確測定對于藥品的質量控制和使用效果的評價以及不良反應的控制具有重要的意義[5],因此,谷氨酸鈉注射液中谷氨酸鈉含量的準確測定是藥品質量控制和用藥效果評價的關鍵步驟。

由于谷氨酸無發色基團且極性較大,難以在C18色譜柱保留,無法直接測定,需要采用衍生化反應將其轉化成易電離物質進行間接測定[2]。高效液相色譜是分析化學中發展最快,應用最廣的領域之一,具有操作方便、準確度高、特異性強等特性[6],使其成為臨床化學、生物學和毒物學等領域中有效分離和質量監控手段[7-8]。質譜檢測具有選擇性好,檢測限低,較高的靈敏度,線性范圍寬,結構簡單,成本低廉,無放射,無污染等優點[9-10]。本研究采用柱前衍生化技術結合高效液相色譜串聯高分辨質譜檢測法測定谷氨酸鈉注射液中谷氨酸鈉的含量,為準確測定谷氨酸鈉注射液中谷氨酸鈉的含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1儀器 超高效液相串聯高分辨質譜儀Triple TOF 5600+(AB Sciex公司,美國),Kinetex C18(2.0×100mm,1.7μm)色譜柱(Waters公司,美國),YY91001-1999型全玻璃注射器(金壇市第二注射器廠制造),H00005型超聲洗滌機(無錫超聲電子設備廠),抽濾設備(HENGAO T&D公司,中國),混合纖維素酯微孔濾膜(北京化工學校附屬工廠),2D-2型自動電位滴定計(上海第二分析儀器廠),BT125D型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)。

1.1.2試劑 谷氨酸(Glutamic acid,Glu,C5H9NO4,色譜純,國藥集團化學試劑有限公司,批號:B2216322),6-氨基己酸(6-Aminocaproic acid,IS,C6H13NO2,色譜純,國藥集團化學試劑有限公司批號:RH431250),谷氨酸鈉注射液(上海旭東海普藥業有限公司),3-溴丙基三苯基磷(3-BMP,C21H21BrP,色譜純,國藥集團化學試劑有限公司批號:K2108775),三乙胺(色譜純,天津市大茂化學試劑廠批號:20211126),實驗用水均為重蒸水。

1.2 方法

1.2.1溶液的配置 1)對照品溶液的配置。參照以下方法配制0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL的對照品溶液:稱取0.0200g谷氨酸,放入10mL容量瓶中,用重蒸水溶解定容,配制成2mg/mL的溶液;稱取0.0100g谷氨酸對照品,放入10mL容量瓶中,用重蒸水溶解定容,配制成1mg/mL的溶液;取此溶液1mL放入10mL的容量瓶中,用重蒸水定容,配制成0.1mg/mL的標準溶液;取0.0050g谷氨酸,放入10mL容量瓶中,用重蒸水溶解定容,配制成0.5mg/mL的溶液;稱取0.0150g谷氨酸,放入10mL容量瓶中,用重蒸水溶解定容,配制成1.5mg/mL的溶液。

2)供試品溶液的配置。精密量取待測谷氨酸鈉注射液1.0mL用重蒸水溶解定容至1000mL,溶解,待測。

1.2.2樣品衍生化反應 現有的氨基酸一般常使用3-BMP作為衍生化試劑,用5%三乙胺提供氨基酸與3-BMP衍生物提供反應所需的堿性條件。

精密稱取0.0040g 3-BMP,加入1mL乙腈和水溶液,超聲溶解,即得衍生化試劑。將其放入冰箱中冷藏,避光保存。

取300μL谷氨酸和50μL內標工作液于聚乙烯管內,加50μL衍生化試劑,60℃下反應30min即可完成衍生化,用于后續測定。

1.2.3色譜條件 色譜和質譜條件:色譜柱為反相色譜柱Kinetex C18(2.0×100mm,1.7μm),流動相的組成為0.1%甲酸水和甲醇溶液,進樣量為1μL,流速為0.40μL/min,使用非數據依賴模式掃描谷氨酸衍生化物母離子和特征碎片分別為 450.18→320.16。

1.2.4流動相和檢測條件的選擇 分別量取0.1%甲酸溶于水和甲醇溶液中作為流動相A和B,在0～5～20min內使用10%～19%～19%的流動相B的梯度測定谷氨酸標準溶液,觀察測定的靈敏度和峰形。

1.2.5標準曲線的建立 由配制的一系列對照品溶液(0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL),依次與3-BMP進行衍生化反應后,分別取一定量,按照1.2.3方法進樣分析,測定峰面積,以谷氨酸的峰面積對其濃度作圖,計算回歸方程(Y=bx+a),即為谷氨酸的標準曲線。

1.2.6重復性試驗 取1.2.1中配置好的1mg/mL的對照品溶液,與3-BMP進行衍生化反應后,重復進樣9次,按照1.2.3方法進樣分析,測定峰面積,計算9次進樣的相對標準偏差。

1.2.7回收率試驗 為了使未加標的樣品與加標的樣品稀釋相同的倍數,在樣品中加入同體積的流動相,即將300μL供試品溶液和300μL的1mg/mL谷氨酸對照品溶液混合,經衍生化后,取20μL混合液進樣。同理將300μL供試品溶液和300μL的流動相混合,經衍生化后,取20μL混合液進樣。再將300μL的1mg/mL谷氨酸對照品溶液與300μL流動相混合,經衍生化后,取20μL混合液進樣。重復5次,得到回收率數據,對5個回收率進行相對標準差的計算。

1.2.8最低檢測限和最低定量限測定 在本實驗條件下,由1mg/mL谷氨酸對照品溶液逐級稀釋,采用1.2.3方法進樣分析,測定進樣濃度下的信噪比(S/N),當S/N=3時的對照品溶液中谷氨酸的濃度即為最低檢測量,當S/N=10時的對照品溶液中谷氨酸的濃度即為最低定量限。

2 結果與討論

2.1 衍生化條件的優化

使用3-BMP標記Glu的具體過程如圖1所示。圖2表明谷氨酸衍生物的母離子和靶向標記氨基官能團的特征碎片450.18→320.16。而后通過非數據依賴型掃描模式檢測谷氨酸,結果如圖3所示,谷氨酸在12.85min溶出。而后通過考察谷氨酸衍生物峰面積,圖4表明隨著反應時間的延長逐漸增大并在100min時趨于平穩,200min時保持不變,因此,當在60℃下衍生100min時,標記效率最高。

圖1 谷氨酸與3-BMP的衍生化反應及化學結構

圖2 谷氨酸衍生物的特征碎片

2.2 標準曲線的建立

分別配制0.024～1000pmol的對照品溶液,依次進樣記錄峰面積。以谷氨酸峰面積為縱坐標,對應濃度為橫坐標,繪制標準曲線,如圖3所示,以谷氨酸的濃度對其峰面積進行線性回歸,得回歸方程為:y=0.0007x+0.003,相關系數R2=0.9999,即在0.024～1000pmol范圍內呈現良好的線性關系。

圖3 谷氨酸衍生物的UHPLC-HRMS色譜圖

圖4 60℃下3-BMP標記谷氨酸反應時間進程

表1 谷氨酸衍生物工作曲線和檢測限

2.3 重復性

取低中高3個濃度的谷氨酸對照品溶液,重復進樣9次,分析操作重復性(結果如表3所示)。在進樣量相同時,各個峰面積大小接近,日內日間RSD為2.19%～3.04%和1.05%～3.97%,表明該方法的重復性良好,可滿足對供試品的測定需求。

表2 通過日內和日間分析確定建議方法的準確度和精密度

2.4 回收率實驗

按照1.2.7方法檢測方法的準確性,結果見表3,下表中樣品中谷氨酸的回收率為86.15%～97.55%,平均回收率為91.71%,RSD為1.67%～2.64%,表明該方法可準確測定谷氨酸的含量,可用于谷氨酸鈉注射液中的樣品濃度測定。

表3 谷氨酸測定的回收率實驗

2.5 最低檢測限

在本實驗條件下,由1mmol/L谷氨酸對照品溶液逐級稀釋至4fmol時,信噪比為3,即方法的最低檢測量為4.00fmol;當谷氨酸對照品溶液濃度為24.25fmol時,信噪比為10,即該方法的最低定量限為24.25fmol。說明該方法的靈敏度高,可滿足檢測需求。

3 結論

選用色譜柱為Kinetex C18(2.0×100mm,1.7μm),流動相為0.1%甲酸水和甲醇溶液,樣本中谷氨酸以3-溴丙基三苯基磷(3-BMP)進行衍生化反應,流速為0.40μL/min,谷氨酸衍生化物母離子和特征碎片分別為450.18→320.16等實驗條件,能較好地檢測出樣品中谷氨酸的含量。

該方法線性范圍寬,靈敏度高,準確度好,可應用到臨床研究中,檢測患者血漿中氨基酸的含量,作為阻塞性心血管疾病危險的早期診斷輔助指標,為患者臨床用藥方案的制定提供參考,也可用于谷氨酸鈉注射液中谷氨酸的含量檢驗工作中,為藥品有效成分含量檢驗具有非常重要的作用。

利益沖突:所有作者均申明不存在利益沖突。