王因花,燕麗萍,孔雨光,吳德軍,任 飛,梁 靜
(1. 山東省林業科學研究院 山東省林木遺傳育種重點實驗室,山東 濟南 250014;2. 山東省國土空間規劃院,山東 濟南 250014)
絨毛白蠟Fraxinusvelutina為木犀科Oleaceae白蠟屬Fraxinus植物,落葉喬木,是我國北方重要的用材、防護及園林觀賞樹種,因其抗逆性強,適應范圍廣而得到廣泛栽培利用。黃河三角洲作為環渤海經濟發展的重要組成部分,其土壤鹽堿化問題突出,生態環境十分脆弱,亟待開發利用。絨毛白蠟具有優異的耐鹽性且壽命長,在鹽堿地改良和生態建設中有很好的應用前景。近年來,我國已選育出諸多生長性狀良好、觀賞性、抗逆性更強的絨毛白蠟優良品種[1-2],但良種資源的規?;c普及程度低,苗木供應不足,已成為其產業化發展的瓶頸。
絨毛白蠟是從美國引進的雌雄異株物種[3],種子繁殖不能保留雙親的優良特性,因此需要無性繁殖技術進行良種培育。扦插繁殖因其操作簡單,是林木無性品種在林業生產中推廣利用的主要繁殖方式。研究表明,絨毛白蠟嫩枝扦插適宜在溫濕度可控的溫室內進行,經NAA 處理后的嫩枝生根率可達100%[4];磁化水處理可極大提高絨毛白蠟嫩枝扦插的生根率和根系效果指數[5];植物生長調節劑處理影響插穗生根率[6],其中,IBA 和NAA 對白蠟嫩枝扦插生根的促進作用較為顯著[7]。
目前,我國白蠟嫩枝扦插技術已取得一定突破,生根率顯著提高,但絨毛白蠟良種嫩枝扦插生根機理尚無系統研究。鑒于此,本研究對絨毛白蠟嫩枝扦插過程中的形態解剖特征進行觀察,分析內源激素含量變化,探討絨毛白蠟嫩枝扦插的生根機制,以期為深入研究絨毛白蠟扦插生根機理提供一定的借鑒。
7 月份,采集絨毛白蠟2 ~3 年生母樹上的半木質化穗條,長度為8 ~10 cm。插穗的下切口呈45°斜剪,上切口平剪,每個插穗保留2 片復葉。扦插基質由椰糠、珍珠巖、蛭石按體積比7∶2∶1配制而成。扦插前24 h 將基質澆透水,并用800倍多菌靈溶液消毒。
1.2.1 試驗設計
以200 mg·L-1IBA 浸泡20 min 為處理組,清水浸泡為對照組,每個處理50 個插穗,重復5 次。其中2 個重復用于切片制作及激素測定,3 個重復用于生根指標調查。
1.2.2 扦插及插后管理
試驗于2021 年7 月份在配有自動噴霧和降溫設施的塑料大棚內進行,棚內溫度控制在30 ~45 ℃,濕度控制在90%以上。插穗處理完畢后,隨即扦插。扦插完成后立即澆透水,并將插孔周圍的基質壓實。
1.2.3 生根調查
扦插后第40 天,調查生根率、不定根數量及不定根長。
1.2.4 取樣及切片制作
以處理組的插穗為樣品,扦插當天取樣1 次,之后每隔7 d 取樣1 次,直至生根為止。截取插穗基部1 cm 處莖段,置于70% FAA 固定液固定24 h 以上。經脫水、包埋后,用石蠟切片機(型號RM2016)切片,切片厚3 μm,番紅固綠染色,二甲苯透明5 min,中性樹膠封片,Olympus 顯微鏡觀察。
1.2.5 內源激素測定
以處理組和對照組的插穗為樣品:扦插后的第0、10、20、30、40 d 隨機抽取插穗基部1 cm處的韌皮部1.0 g 左右,重復3 次,用錫紙包好后立即放入液氮中冷凍保存。用ELISA 法進行IAA、ABA、ZR 及GA3含量測定。
1.2.6 數據統計與分析
采用Excel 2016 補充版本進行數據統計和作圖,SPSS 23.0 軟件進行方差分析與多重比較。
扦插后第40 天對處理組和對照組的生根率、不定根數量及不定根長度進行統計分析,結果見表1。結果表明,對照組的生根率為80.7%,處理組的生根率為96.7%,兩者之間差異顯著(P<0.05);對照組的總根數平均為7.7 條,不定根長度平均為6.2 cm,而處理組的總根數平均為8.2 條,不定根長度平均為7.8 cm,對照組和處理組的總根數、不定根長度之間在統計學上無顯著差異。由此可見,外源IBA 顯著提高了絨毛白蠟的嫩枝扦插生根率。
表1 對照組和處理組扦插生根指標分析?Table 1 Analysis of cutting rooting indexes of CK and treatment group
以處理組的插穗為材料,取樣過程中同時進行插穗外部形態觀察。扦插后第7 天,插穗切口處已有少量白色愈傷組織形成;第14 天,韌皮部與木質部之間被愈傷組織充滿;第21 天,愈傷組織繼續膨大,尚未觀察到不定根生成;第28 天,有少部分插穗在切口處的皮部長出幼嫩的乳白色根系,此后插穗開始陸續生根;第40 天,大部分插穗已生根。經觀察,絨毛白蠟為皮部生根類型,具體情況見圖1。
圖1 絨毛白蠟生根過程Fig. 1 Rooting process of F. velutina
扦插前絨毛白蠟的莖橫切面結構見圖2a。由圖2a 可以看出,絨毛白蠟的橫切面結構由外到內可分為表皮、皮層、韌皮部、形成層、木質部、髓六部分。表皮的最外層為緊密排列的柱狀細胞,往內由2 ~3 層長方形細胞排列而成,表皮染色顏色較深。表皮內部是由數層薄壁細胞組成的皮層,皮層細胞形狀不規則,排列較疏松;從皮層向內部看,有一圈團狀的韌皮纖維,但韌皮纖維不是連續的;韌皮纖維內部依次為韌皮部、維管形成層、木質部和髓。經過多張橫面段結構圖的觀察,在絨毛白蠟莖段中未發現根原基。
圖2 絨毛白蠟嫩枝扦插生根過程的解剖結構Fig. 2 Anatomical structure of softwood cutting during rooting process of F. velutina
圖3 扦插生根過程中內源激素的變化情況Fig. 3 Changes in endogenous hormones during the rooting process of cuttings
進一步觀察絨毛白蠟的生根過程發現,扦插生根可以大致分為根原始細胞的形成和分化、根原基的形成以及不定根的表達3 個階段。圖2a 為扦插前絨毛白蠟莖的橫切面結構。扦插第14 天左右,觀察到靠近維管形成層的韌皮部薄壁細胞分生形成根原始細胞團(圖2b),根原始細胞團不斷進行分裂;第21 天左右,形成近三角形的根原基(圖2c),根原基朝著皮層方向生長,并從韌皮纖維間隙處到達皮層;第28 天左右,突破種皮形成不定根(圖2d)。
扦插后第7 天左右,插穗切口處的韌皮部和木質部之間開始形成愈傷組織,愈傷組織不斷生長,直至充滿整個切口,但在愈傷組織內并未發現根原基(圖2e)。愈傷組織的形成可以保護插穗免受病菌進入,從而降低插穗腐爛率。
圖3 為扦插生根過程中內源激素IAA、GA3、ZR 及ABA 的變化情況。由圖3a 可以看出,從扦插開始,處理組和對照組的IAA 含量始終處于上升趨勢,尤其是在不定根形成期,IAA 含量大幅上升,且處理組的IAA 含量始終高于對照組的IAA 含量,至扦插第40 天,處理組的IAA 含量比扦插前提高了20.3%,對照組的IAA 含量比扦插前提高了11.1%。
圖3b 為處理組和對照組的GA3含量變化情況??梢钥闯?,處理組和對照組的GA3含量呈現出相反的變化趨勢。自扦插開始至第30 天,處理組的GA3含量逐漸下降,第30 天降至最低,而后逐漸升高;對照組的GA3含量變化趨勢則恰好相反,自扦插開始至第30 天,對照組的GA3含量持續升高,第30 天后達到峰值,而后逐漸降低??傮w來看,對照組的GA3含量始終高于處理組的GA3含量。
圖3c 為處理組和對照組的ZR 含量變化情況??梢钥闯?,處理組的ZR 含量也是以扦插的第30天為分界點,30 天內其ZR 含量逐漸上升,第30天達到峰值,而后逐漸下降;對照組的ZR 含量則一直處于上升狀態,前20 天內處理組的ZR 含量高于對照組的ZR 含量,20 天后對照組的ZR 含量則高于處理組的ZR 含量。
圖3d 為處理組和對照組的ABA 含量變化情況??梢钥闯?,處理組的ABA含量變化趨勢較復雜,呈現出上升—下降—上升的趨勢,對照組的ABA含量則是先下降然后持續上升,且處理組的ABA含量始終高于對照組的ABA 含量。
植物生長調節劑在提高扦插生根率方面發揮著重要作用,尤其對于難生根的樹種,其效果更為顯著[8]。路斌等[9]研究了IBA、IAA、NAA 對金葉白蠟扦插生根率的影響,結果表明3 種生長調節劑都可顯著提高金葉白蠟的生根率和生根數,其中以IAA 和IBA 的混合液效果最好,可顯著提高插穗體內SOD、POD 及PPO 酶的活性,有利于插穗生根。本研究中,對照組的生根率為80.7%,處理組的生根率為96.7%,兩者之間差異顯著,說明IBA 的使用顯著提高了絨毛白蠟嫩枝扦插的生根率,這與何立在對節白蠟的相關研究中得出的結論相同[7],但對照組與處理組在不定根數量和不定根長度方面并無統計學上的顯著差異。
植物的莖是扦插材料中應用最廣泛的一種,其結構與植物的生根能力密切相關[10-11],因此,莖的解剖結構、根原基類型及生根類型是扦插解剖學的研究重點[12]。
絨毛白蠟的莖段結構主要包括周皮、皮層、韌皮部、形成層、木質部和髓,其中在皮層與韌皮部之間存在環狀的韌皮纖維。有研究認為,韌皮纖維會對根原基的生長形成物理阻礙,進而導致生根困難[13],但也有人指出,只要該層厚壁組織不是處于連續狀態,則較易產生不定根[14-15]。本研究中,絨毛白蠟莖的解剖結構中雖然存在韌皮纖維,但該層纖維組織并不連續,而是和薄壁細胞組織相間排列,從而在一定程度上減少了不定根發生、生長的阻力。
在植物的扦插生根過程中,不定根的起源可分為潛伏根原始體和誘生根原始體[16]。潛伏根原始體是指在植物體內休眠的根原始細胞,當離體植物材料被置于適宜的環境條件下時,潛伏根原始體將恢復分裂能力并逐步發育成為不定根。而誘生根原始體則是指在植物體內本來不存在的根原始細胞,于特定條件下扦插后被誘導形成,例如朝鮮崖柏、草原櫻桃、韃靼忍冬等[17-19]。本研究在絨毛白蠟當年生莖的解剖結構中未發現根原基的存在,而是扦插后才形成根原基,說明絨毛白蠟的生根類型為誘導生根型。
根原基可來源于愈傷組織[20]、髓射線細胞[21]、維管形成層、韌皮薄壁細胞、葉隙薄壁組織細胞等[22]。通過對絨毛白蠟生根過程進行觀察,發現其根原基起始于緊鄰形成層的韌皮部薄壁細胞,在其他位置尚未觀察到根原基的存在。
根據不定根的生長位置可以分為皮部生根、愈傷組織生根以及混合生根等類型。魯丹等[23]研究發現,紅愷木屬于混合生根類型,以皮部生根為主,兼有少量愈傷組織生根;周容濤等[24]研究了歐美雜種山楊的不定根發育的解剖結構,認為其屬于皮部生根類型。本研究中,絨毛白蠟的切口處雖然形成了較多的愈傷組織,但在愈傷組織內未見根原始細胞,說明絨毛白蠟愈傷組織的形成與不定根的發生是兩個相互獨立的過程[25-26],但愈傷組織在一定程度上保護絨毛白蠟的插穗不受病菌感染[27],降低了插穗腐爛率,對不定根的形成有一定的保護和促進作用。但應注意的是,如果愈傷組織過于發達而過度爭取插穗內的營養成分,并不利于不定根的形成。經觀察發現,絨毛白蠟的根原基發源于維管形成層附近的韌皮薄壁細胞,為皮部生根類型。
不定根的生成是受多種內源激素共同調控的復雜過程。隨著植物扦插生根機理的深入研究,人們對生長激素在促進不定根生成中的作用有了更加明確的認識,其中生長素被認為對不定根的生長發育起到核心作用[28]。敖紅等[29]研究了內源激素與長白落葉松扦插生根率的關系,發現IAA含量高的插穗具有明顯較高的生根率,該研究還指出,IAA 在促進不定根形成的過程中發揮兩個重要作用:一是刺激酶系統的活躍,增強呼吸作用和代謝作用,同時促進細胞分化形成愈傷組織;二是使插穗內部的營養物質集中到插穗切口處,從而有利于生根。韓華[30]在分子水平上對雜種落葉松的扦插生根進行了研究,發現能量代謝調控和信號傳導調控是調控插穗不定根發生的兩個重要方面,并且鑒定出與生長素信號轉導有關的兩種蛋白。本研究中,處理組和對照組的IAA 含量始終處于上升趨勢,尤其是在不定根生長期,IAA含量大幅提高,說明IAA 與絨毛白蠟不定根的形成和生長密切相關,該結果與在菊花、歐洲云杉、珍珠黃楊等植物中的研究結果一致[31-33]。另外,處理組的IAA 含量始終高于對照組,說明外源IBA 的使用可以有效提高插穗體內的IAA 含量,更有利于促進插穗生根。
許多研究表明,細胞分裂素和赤霉素類在植物的扦插生根中起到抑制作用[34-35],但不能一概定論,不同樹種可能存在不同的激素作用機理差異。李朝嬋等[36]在對長蕊杜鵑的研究中發現,GA3含量與不定根的形成正相關;李永欣等[37]研究了光皮樹扦插生根過程中內源激素的變化情況,認為低濃度的ZR 有利于根原基的分化,高濃度的ZR 有利于根原基生長發育;韓繼紅等[38]則認為ZR 有利于無患子硬枝扦插的根原基和不定根生成。本研究中,處理組的GA3含量在扦插期的前30 天內持續下降,此階段正是不定根的形成發育期,說明GA3含量降低有利于絨毛白蠟根原基的生成和發育;30 天后其GA3含量升高,有利于不定根的伸長生長。而對照組的GA3含量變化趨勢恰好與處理組相反,說明外源IBA 的使用對插穗體內的GA3變化有一定的影響。處理組的ZR 含量在愈傷組織形成期和根原基形成期上升,在不定根生長期則開始下降,說明高濃度的ZR 有利于絨毛白蠟根原基的形成,低濃度則有利于不定根的生長,這與人們在珍珠黃楊、光皮樹中得出的結論較一致[30,35]。通過觀察GA3 和ZR 的含量變化,發現外源IBA 的使用可以有效調節插穗內激素含量,使其向促進生根的方向發展。
很多研究認為ABA 對不定根的生成有抑制作用,但在本研究中,處理組的ABA 含量表現出上升—下降—上升的趨勢,值得注意的是,處理組的ABA 含量始終高于對照組的ABA 含量,說明在絨毛白蠟扦插苗不定根的生成過程中,ABA 并未起到抑制作用,甚至對不定根的生長有一定的促進作用。楊雪萌等[31]在菊花扦插的研究中也得到了類似的結果,但ABA 的具體作用機制尚待更加深入開展研究。
植物的扦插生根是一個極其復雜的生理過程,除本研究所涉及的解剖結構和內源激素外,其他因素如植物體內氧化酶的活性、可溶性糖、可溶性蛋白、碳氮化合物等營養物質含量及相關基因的表達調控都與根原基的形成密切相關[39]。在后續的研究中,應深入探索影響因子的代謝與調控,以對白蠟生根機理獲得更加全面的認識[40]。此外,本研究僅觀察到了皮部生根類型,對于白蠟屬其他植物是否存在愈傷生根現象以及愈傷生根的機理等問題,也需要進一步深入研究。
絨毛白蠟的生根類型為誘導生根型,根原基發源于維管形成層附近的韌皮薄壁細胞,為皮部生根類型。IAA 與絨毛白蠟不定根的形成和生長密切相關,外源IBA 的使用可以有效調節插穗體內的IAA、GA3和ZR 含量,更有利于促進插穗生根。ABA 對絨毛白蠟的扦插生根沒有抑制作用,但其作用機理尚待更加深入開展研究。