不同施肥方式對杉木容器育苗基質真菌群落的影響

馬東旭，王佳琪，藍偉立，陳塊明，李 茂，葉義全，范福金，林開敏

（1. 福建農林大學 林學院，福建 福州 350000；2. 國家林業和草原局 杉木工程技術研究中心，福建 福州 350000；3. 福建省洋口國有林場，福建 南平 353000）

土壤真菌是土壤微生物群落中重要的分解者，能夠分泌相應酶分解有機物為植物生長提供有效養分[1]。由于土壤真菌群落結構對環境因素變化較為敏感，因此將其作為評價土壤質量狀況的重要指標[2]。相關研究表明土壤真菌群落結構與多樣性主要受不同管理措施、土壤肥力、土壤類型、栽培植物類型、溫度、水分等綜合因素有關[3-4]。通過調控土壤真菌群落結構與多樣性有利于改善土壤肥力、增加土壤養分有效性，提高土壤生產力[8]。

杉木Cunninghamialanceolata作為我國南方主要造林樹種[5]，兼具速生豐產與材質優良的特性。杉木幼苗時期生長迅速，對養分需求較高，而土壤真菌群落對土壤營養元素的周轉有重要調節作用，有利于加快養分循環，可為杉木幼苗生長提供有利條件。

近年來，人們對木材需求以及質量要求日益增長，對優質良種苗木的需求也不斷增加。施肥作為提高苗木質量的主要措施，在改善土壤肥力，促進苗木生長的同時，對土壤微生物的群落結構與多樣性具有重要調控作用[6-7]。因此，合理施肥能維持土壤穩定的真菌群落結構與多樣性，對改善土壤肥力和為杉木幼苗生長提供養分有重大意義。

目前通過高通量測序技術開展施肥對土壤真菌群落結構的研究已有許多報道，但這些研究多集中于農田作物栽培中，如茶樹[8]、冬小麥[9]、番茄[10]等，并取得了較好研究成果。有關木本植物的研究則相對較少，有關杉木幼苗土壤真菌群落和功能多樣性[11-12]已有相關報道，有關不同施肥對杉木容器育苗基質真菌群落結構影響的研究卻鮮有報道。有鑒于此，以栽培杉木無性系幼苗的輕型基質為對象，基于高通量測序技術，對不同施肥方式下輕型基質真菌群落結構組成和多樣性進行系統分析，比較不同施肥處理下的基質真菌群落結構差異，從微生物角度來研究不同施肥方式對杉木容器育苗基質真菌群落結構和多樣性的影響及其與環境因子之間的關系，為施肥調控杉木容器育苗基質真菌群落提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

由福建洋口林場采穗圃提供生長勢一致的“洋061”優良無性系杉木穗條，長度為9.0±0.5 cm。2018 年4 月初采用無紡布袋（直徑5.5 cm×高9.5 cm），將輕型基質（泥炭土∶珍珠巖∶杉木皮=1∶2∶2（體積比））裝入其中，并置于塑料托盤上。將裝好輕型基質的托盤放置于平整苗床之上，在苗床上方鋪一層黑色遮陽網，扦插前對基質進行澆水以保持濕潤。輕型基質初始理化性質如下：容重0.17 g/cm3，總孔隙度58.8%，含水率29.2%，pH 值5.87，全氮9.93 g/kg，水解氮0.26 g/kg，有效磷0.64 g/kg，速效鉀11.3 g/kg，有機質295 g/kg。

1.2 試驗設計

2018 年5 月23 日進行扦插，將穗條基部裹上黃泥，扦插于輕型基質中。扦插一個月后（2018年6 月22 日）待苗木扦插成活，選取長勢一致的幼苗作為試驗材料進行指數施肥試驗，使用氮磷鉀復合肥（N∶P2O5∶K2O=16∶16∶16）對杉木幼苗進行施肥處理，采用霍格蘭營養液對其進行中、微量元素補充，除氮、磷、鉀外其他元素每個處理施入量相同，施肥量以施氮量來表示[11-12]，以便直觀呈現，施肥方案與進度見表1。

表1 杉木“洋061”無性系苗施氮進程表Table 1 Nitrogen application progress for the superior clone of C. lanceolate “Yang 061”

試驗共設置3個處理，分別為總施氮量0 mg/株（不施肥處理為對照，CK）、總施氮量40 mg/株（常規集中施肥處理，CF）、總施氮量40 mg/株（指數施肥處理，EF）；每個處理設置3 個重復，每個重復40 株苗。其中常規集中施氮總共施兩次（第一周和第六周），每次施氮20 mg/株；氮素指數施肥每7 天施肥1 次，共施肥10 次，施氮量參照指數施肥模型[13]設置。杉木“洋061”無性系穗條初始氮含量為5.764 mg/株，試驗期間進行正常的田間管理和苗木病蟲害防治，施肥至2018年8 月24 日。

1.3 基質樣品采集與處理

待施肥結束后半個月即2018 年9 月8 日，對苗木輕型基質進行取樣，剪開基質袋放入塑料自封袋中，隔袋除去基質袋和扦插苗，混勻塑料袋中基質[12]，取3g 裝入無菌袋中并放入裝有足量液氮的保溫盒中。采用ITS rDNA 對其真菌群落多樣性進行高通量測序。

1.4 基質養分測定

自2018 年6 月8 日—2019 年6 月8 日，每90 天測定1 次，每次選擇3 株平均株。取基質混勻，放在干凈的牛皮紙上自然陰干，研磨成粉狀，過0.149 nm 細篩，采用H2SO4-HClO4法消煮基質，電感耦合離子發射光譜儀（PE optima 8000）測定基質養分。水解氮、有效磷、速效鉀參照國標分別采用堿解擴散吸收法（LY/T 1229—1999）、氟化-鹽酸浸提法（LY/T 1233—1999）、火焰光度計法（LY/T 1236—1999）。C、N 元素使用全自動碳氮分析儀（Vario Macro Cube）測定[14]。

1.5 基質真菌測定

1）DNA 提取

基質真菌總DNA 采用MOBIO 公司的PowerSoilKit 試劑盒提??；對提取后的DNA 產物經瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，合格DNA 稀釋至1 ng/μL 保存于-80 ℃用于PCR 擴增，采用帶有Barcode 的特異引物擴增DNA 樣本中特定區域，具體擴增信息見表2。擴增程序為：95 ℃預變性2 min，隨后98 ℃變性10 s，62 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共27 個循環后68 ℃延伸10 min[15-21]。

表2 真菌多樣性測序引物信息Table 2 Diversity sequencing primer information of fungal

2）PCR 產物的混樣和純化

PCR 產物使用濃度2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據PCR 產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用1×TAE 濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR 產物，剪切回收目標條帶。產物純化試劑盒使用Thermo Scientific 公司GeneJET 膠回收試劑盒回收產物。

3）文庫構建和測序

對擴增產物切膠回收，使用Quanti Fluor TM熒光計對回收產物進行定量。將純化的擴增產物進行等量混合，連接測序接頭，使用New England Biolabs 公司的NEB Next? Ultra ? DNA Library Prep Kit for Illumina 建庫試劑盒進行文庫的構建，構建好的文庫經過Qubit 定量和文庫檢測，合格后使用Hiseq 2500（Illumina, SanDiego）的PE250 模式上機測序。

1.6 數據處理

微生物群落多樣性結果使用FLASH 軟件對原始數據進行質量過濾和雙端序列的拼接，得到有效數據。采用Uparse 軟件，相似度≥97%的序列歸為1 個操作分類單元即OTUs（operational taxonomic units）[22-24]，利用Greengene 數據庫進行物種注釋；運用QIIME 軟件對所得優質序列進物種分類分析，對OTUs 進行豐度、多樣性指數等分析，將相對豐度大于0.1%的門與目定義為優勢類群；使用Excel 2010 軟件對數據進一步整理，SPSS 26.0 軟件對數據進行單因素分析、Duncan 多重比較、person 相關性分析、主成分分析，采用Canoco 5.0 軟件進行冗余分析（RDA），Orign 8.5軟件進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 輕型基質理化性質對不同施肥方式的響應

不同施肥方式對基質養分含量產生了較大影響（表3）。與CK 相比，EF 處理后的基質AN、TP、TK、AP、AK、TN 含量增加幅度均大于CF處理，且CF 處理后的AN、AK 含量相較CK 有所降低；方差檢驗結果表明，EF、CF 處理較CK均顯著提高了基質中TN、AP 含量，其中AP 含量變化最為顯著，分別提高21.69%和12.44%；綜上表明指數施肥較常規施肥更有利于基質養分積累。

表3 指數施肥對基質理化性質的影響Table 3 Effect of exponential fertilization on physical and chemical properties of substrate

2.2 輕型基質真菌群落測序結果及OTU 統計分析

CK、EF、CF 處理獲得的平均序列數分別為14 598、22 022、17 782，測序量均已達到飽和狀態（表4）。通過韋恩圖將各處理間真菌群落OTU 的重疊關系呈現出來[17]（圖1），EF、CF、CK 處理中的OTU 數分別為665、473、397，表現為EF ＞CF ＞CK；特有OTU 數分別為288、194、165，表現為EF ＞CF ＞CK，表明指數施肥對基質真菌群落OTU 有明顯促進作用。

圖1 不同施肥處理下真菌OTUs 韋恩圖Fig. 1 Venn diagram of fungi OTUs under different fertilization treatments

表4 不同處理土壤真菌群落的α 多樣性指數Table 4 α diversity indices of soil fungi community in different treatments

2.3 輕型基質真菌群落α 多樣性與群落組成

基于整體OTUs 水平的基質真菌群落α多樣性結果顯示（表4），多樣性指數（Shannon 指數和Simpson 指數）表現為EF ＞CK ＞CF，與CK處理相比，EF 處理下的Shannon 指數和Simpson指數分別增加15.21% 和7.41%，且Simpson 指數達到顯著變化水平（P＜0.05）；CF 處理下的Shannon 指數和Simpson 指數則分別降低10.19%和3.85%，沒有達到顯著水平（P＞0.05）；EF、CF 處理下的豐富度指數(Chao1 和ACE 指數)較CK 均顯著降低（P＜0.05），表現為CK ＞CF ＞EF，EF、CF 處理下的Chao1 指數較CK分別減少47.21%、32.43%，ACE 指數分別減少43.16%、31.82%（P＞0.05）。綜上表明，對比CK，指數施肥會增加基質真菌多樣性指數，降低豐富度指數?；诨|整體OTU 水平的相異系數bray-curtis 距離矩陣進行主坐標分析（圖2），兩軸共解釋了群落結構差異的48.8%。Permanova 檢驗表明兩種施肥下的真菌群落較CK 沒有發生顯著分離（P=0.37），綜上表明短期兩種施肥方式沒有顯著改變基質真菌群落組成。

圖2 不同施肥處理下的基質真菌群落NMDS 分布Fig. 2 NMDS distribution of matrix fungi community under different fertilization treatments

2.4 輕型基質真菌群落結構在門與屬水平上的分布特征

高通量測序結果顯示，3 個處理中共包含7門、23 綱、41 目、69 科、83 屬?；陂T水平，除去相對豐度小于0.1%和未能歸類的其他類真菌，各個處理一共獲得5 個類群（圖3）分別為擔子菌門Basidiomycota(40.61%～46.02%)、子囊菌門Ascomycota（25.97% ～35.94%）、被孢霉門Mortierellomycota（1.17% ～10.04%）、 壺菌門Chytridiomycota（0.43% ～4.01%）、 毛霉門Mucoromycota（0.32%～1.35%）。施肥后基質真菌門水平相對豐度發生明顯變化，與CK 相比，EF 處理明顯降低子囊菌門相對豐度約為25.72%（P＞0.05），擔子菌門呈相反趨勢，增加了15%（P＞0.05）；被孢霉門相對豐度相較于CK 顯著增加了2.5 倍（P＜0.05），壺菌門減少了77%（P＞0.05）；CF 處理下的子囊菌門、擔子菌門、被孢霉門相對豐度均呈下降趨勢，壺菌門呈明顯上升趨勢，但均沒有達到顯著水平。為進一步探究指數施肥對基質真菌群落組成的影響，選擇相對豐度大于0.1%的目水平（10 個）進行熱圖分析（圖4），結果顯示EF、CF 處理聚為一類，兩種施肥后的真菌群落組成較CK 有明顯分離，表明不同真菌目水平受施肥影響顯著。與CK 處理相比，CF 處理下的粗糙孔目（Trechisporales）、糞殼菌目（Sordariales）相對豐度顯著下降57.14%和48.13%， 而肉座菌目（Hypocreales） 相對豐度則顯著增加3.6 倍；EF 處理下的糞殼菌目（Sordariales）相對豐度顯著下降67.77%，而被孢霉目（Mortierellales）與肉座菌目（Hypocreales）的相對豐度較CK 處理顯著增加2.5 和3.15 倍；EF 與CF 處理間僅粗糙孔目（Trechisporales）存在顯著差異。

圖3 基于門分類水平上的基質真菌群落結構組成Fig. 3 Community structure composition of matrix fungi based on phylum classification level

圖4 各處理基質優勢真菌在目水平的群落熱圖分析Fig. 4 Heat map analysis of the main fungi at the order level in each treatment substrate

2.5 輕型基質真菌多樣性、群落組成與土壤理化性狀的冗余分析

圖5a 結果顯示前兩個軸特征值一共解釋了基質真菌多樣性變異程度的96.65%。其中，基質真菌多樣性指數（Shannon 指數和Simpson 指數）與全氮、全鉀、速效鉀、pH 值呈正相關，與水解氮、全磷、速效磷呈負相關；豐富度指數（Chao1和ACE 指數）則與速效磷、全磷、水解氮、全鉀呈正相關，與全氮、速效鉀、pH 值呈負相關。Monte Carlo 檢驗結果表明，速效磷與全鉀對基質真菌多樣性貢獻率最大，分別為39.2%、31.4%，且速效磷影響顯著（P=0.02）?？梢?，本試驗條件下，速效磷是驅動基質真菌多樣性變化的主要環境因子。

圖5 基質真菌多樣性指數、目水平類群分布與土壤理化性狀間的多元分析Fig. 5 Multivariate analysis of diversity index, order level distribution of matrix fungi and soil physical and chemical properties

基于目分類水平（圖5b），兩個排序軸累計變量能在77.57%上解釋基質真菌群落結構組成的差異性。壺菌目、格孢菌目、刺球殼目相對豐度均與全氮、全鉀和pH 值呈正相關，與速效鉀、水解氮、有效磷、全磷呈負相關，散囊菌目、圓盤菌目、Thelebolales、糞殼菌目相對豐度與pH 值和速效鉀呈正相關，與全鉀、全氮、水解氮、全磷和速效磷呈負相關，糙孢孔目、肉座菌目、被孢霉目相對豐度與速效磷、全磷、全氮呈正相關，與全鉀、全氮、水解氮、pH值呈負相關。Monte Carlo檢驗結果表明，pH 值與全氮對基質真菌目水平群落分布的貢獻率最大，分別為35.4%、25%，且二者影響均達到顯著水平（P=0.014，P=0.008)。因此，pH 值與全氮是影響基質真菌群落分布的主要環境因子。

2.6 輕型基質真菌優勢屬與杉木苗生長特性的相關性分析

由表5 可知，通過EF 與CF 處理，杉木苗高、地徑、總生物量相較CK 處理均有顯著增加，均表現為EF ＞CF ＞CK。綜上，在同等施肥量的情況下，指數施肥效果最佳，比傳統常規施肥能更有效促進苗木生長。為進一步分析杉木生長特性與基質真菌群落的關系，將真菌群落差異物種（目水平）與杉木生長指標進行相關性分析發現（圖6），苗高、地徑、生物量糞殼菌相關性較小，與被孢霉目呈顯著正相關（P＜0.05），地徑、生物量分別與糙孢孔目和肉座菌目呈顯著正相關（P＜0.05）?？傮w上說，基質真菌差異物種相對豐度與杉木幼苗生長有較為緊密的聯系。其次，只有糙孢孔目與被孢霉目之間存在顯著正相關，其余差異物種之間相關性相對較弱，存在較少的競爭關系。

圖6 基質真菌差異物種與杉木苗生長指標的相關關系Fig. 6 Correlation between different species of matrix fungi and growth index of C. lanceolata

表5 不同施肥方式對杉木苗生長的影響Table 5 Effects of different fertilization methods on the growth of C. lanceolata seedlings

3 討 論

3.1 指數施肥處理對杉木苗輕型基質真菌α 多樣性的影響

目前有關施肥對真菌α多樣性的影響結論并不一致，Yang 等[18]研究結果表明施肥會引起土壤微生物種間發生競爭，對營養元素敏感的微生物類群吸收營養元素以后迅速生長，進而會抑制其他對營養元素不敏感的微生物類群的生長與繁殖，最終導致微生物多樣性降低[19]；謝歡等[20]等通過選取杉木幼苗進行短期施肥發現，土壤真菌多樣性指數明顯下降，但沒達到顯著變化的水平；陳祖靜[21]以桉樹幼林為研究對象，進行短期不同氮水平添加后發現土壤真菌多樣性指數與豐富度指數均有明顯降低。在本研究中，兩種施肥處理下的基質真菌豐富度指數較CK 呈顯著下降趨勢，分析認為，施肥改變了基質的微環境，促進了一些對環境變化敏感的微生物種群的生長，進而會抑制其他不敏感的微生物種群生長，導致整體豐富度下降；另外表示群落內優勢種地位和作用的Simpson 指數在施肥后明顯提高，在EF 處理下達到最大，這與陳祖靜等[21]對桉樹人工林土壤真菌多樣性的研究結果大致相同。土壤理化性質對真菌多樣性指數的影響已被證實，何敏紅等[22]、王小玲等[3]、Zhou 等[23]發現，土壤pH 值、土壤有效養分含量、土壤有機碳含量是影響土壤真菌多樣性變化的主要驅動因子。本研究中，速效磷是影響基質真菌豐富度與多樣性指數的主要環境因子，這與張海芳等[19]研究結果一致，施肥能夠有效改變土壤養分有效性進而直接影響土壤真菌多樣性。此外，真菌周轉時間較長，短期能在酸性環境中穩定生長，Sun 等[24]研究發現進行長期施肥較短期施肥能夠顯著改變土壤理化性質，影響基質真菌多樣性。因此，在以后的實驗中應考慮長周期施肥對真菌群落多樣性的影響。

3.2 指數施肥處理對杉木苗基質真菌群落組成的影響

不同施肥處理下，土壤養分不同，微生物群落結構的整體組成也會存在差異，但優勢種群基本一致。本研究發現各處理下的基質真菌優勢菌門均為擔子菌門、子囊菌門、被孢霉門，擔子菌門與被孢霉門相對豐度在EF 處理下達到最大；子囊菌門相對豐度在施肥后均明顯降低，這與Guo等[25]研究結果不一致，分析認為，施肥增加了水解氮含量，子囊菌門對N 有效性極為敏感，其相對豐度較不施肥前會有明顯增加。這可能因為本研究的施肥水平較低，加之施肥時間較短，因此沒有顯著改變基質水解氮含量。另外，陳祖靜等[21]對尾葉桉幼苗進行長達9 個月的施肥研究，發現短期施肥僅能改變對養分有效性較為敏感的真菌類群，Guo 等[25]通過對日本落葉松幼苗進行為期3 月的施肥實驗，同樣得到相似結果。在目水平上，糞殼菌目被李鑫等[26]報道不僅參與凋落植物營養器官的重要分解者，和肉座菌目一樣在有機質分解過程中扮演重要作用，本研究發現兩種施肥方式較CK 顯著降低了糞殼菌目的相對豐度，RDA分析結果顯示與水解氮呈負相關，表明糞殼菌目在短期兩種施肥條件下，容易受N 有效性抑制。而肉座菌目相對與速效磷呈顯著正相關，表明肉座菌目對P 有效性較為敏感。另外本研究還發現EF 較CK 處理顯著增加了被孢霉目的相對豐度。Lee 等[27]證實被孢霉目擁有轉化有機化合物的能力，當外界環境發生變化時，能通過利用植物分泌物來溶解土壤P。喬志偉等[28]也發現被孢霉目與速效磷呈顯著正相關關系，這與本研究RDA 分析結果基本相同，說明被孢霉目在短期施肥后的土壤P 轉化過程中有重要作用。其次，相關性分析結果顯示被孢霉目與苗高、地徑、生物量均有顯著正相關關系，表明被孢霉目在杉木幼苗P 供應與基質P 轉化過程中的扮演重要的微生物角色。謝歡等[20]研究結果同樣證實，短期施肥能夠通過調控與P 轉化有關的真菌功能類群，分解土壤養分提高養分有效性，促進杉木幼苗生長。

因此推測，兩種施肥方式可能在一定程度上促進了難分解有機質與P 轉化相關的真菌類群生長，進而影響基質真菌群落結構，真菌類群加快了基質中速效養分的轉化與積累，

為杉木幼苗生長提供了條件，其深層原因還需要結合其相應的真菌功能類群來揭示。有報道稱杉木是叢枝菌根樹種，菌根能通過增加宿主根表面積與地下菌根網絡增加宿主對養分的利用率，因而后期實驗還需要對植株根系上定殖的重要菌根類群進行鑒別。

4 結 論

兩種施肥明顯增加了基質中養分含量，與常規施肥相比，指數施肥顯著增加了速效磷、速效鉀、全氮的含量，提高了基質真菌Simpson多樣性指數，降低了豐富度指數，促進了基質真菌優勢種群增長，全氮、pH 值是影響基質真菌群落結構的主要環境因子。兩種施肥方式能夠通過調控杉木容器育苗基質的真菌群落組成來影響植物幼苗生長。指數施肥較常規施肥能顯著促進磷轉化和有機質分解真菌類群的增長，更有利于基質后期有效養分積累，為杉木幼苗生長提供良好條件。目前關于杉木容器育苗基質真菌群落結構對短期指數施肥方式的響應的研究相對較少，具體的影響機制還需要結合具體真菌功能類群與土壤環境因子之間的關系來進一步揭示。