一株耐高氨氮好氧反硝化細菌的鑒定及脫氮性能研究

馮雨薇，蘇新國，孫慧明，林浩澎，陳瓊華，舒 琥

廣州大學 生命科學學院，廣東 廣州 510006

近年來，我國工廠化養殖水產品產量持續上升，2021 年達679 908 t[1]，隨之而來的養殖污染也呈加劇趨勢。富含蛋白質的商業飼料是水產養殖系統中的主要氮 (N) 源，但只有約25%的飼料可以轉化為魚類的生物量[2]；氨氮 (NH4+-N)、硝態氮(NO3--N)、亞硝態氮 (NO2--N) 等含N 化合物成為工廠化養殖系統中的主要污染物。隨著養殖密度的不斷增大，飼料投喂量增加，殘留餌料、殘骸、魚糞等含N 污染物也不斷增加[3-4]。這些含N 污染物在微生物的作用下進行蛋白質脫氨作用產生NH+4-N，進而被氧化成NO2--N、NO3--N。在水產養殖系統中，3 種含氮化合物的含量不同，其中NH4+-N 的生成量最大，但這些N 污染對養殖水生動物均有不同程度的毒害作用，長時間暴露其中會破壞魚體的鰓組織、干擾生物體氧化過程，導致生長減緩、肝組織惡化甚至死亡[5]。此外，NH4+-N 濃度過高還會導致水體富營養化，溶解氧含量下降，有毒物質增加，進而破壞水產養殖系統的生態平衡[4]。因此，亟須經濟有效的方法清除水產養殖系統中的N 污染，避免水產養殖業遭受巨大的經濟損失。

為了減少NH4+-N 及其他N 污染，人們通過充氧曝氣、物理化學法、生物法等手段進行治理，實現工廠化養殖水體的循環再利用[6]。物理化學方法包括反滲透、電滲透析和離子交換，需要高昂的運營和維護成本，并會產生二次廢物。與之相比，生物法省時高效且成本低，極具發展前景[7]。好氧反硝化細菌以生長周期快、脫氮周期短、降解能力強的優點常被運用于生物修復。目前已有研究發現的好氧反硝化細菌種類有芽孢桿菌屬 (Bacillus)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)、產堿桿菌屬 (Alcaligenes)、紅球菌屬 (Rhodococcus)等，能將水體中的含N 化合物還原為氣態N 進而有效減少水中N 污染[8]。例如，劉方劍[9]篩選出的菌株WZ17 具有高效脫氮性能，對NH4+-N、NO2--N 和NO-3-N 的去除率分別為99.31%、91.82%和83.60%；Xia 等[10]從淡水中篩出菌株ND7 可在低濃度條件下 (約50 mg·L-1)分別去除約99.8%的NH4+-N、96.2%的NO2--N 和97.18%的NO3--N，表明好氧反硝化細菌具有較好的脫氮作用。但僅有少數研究者對反硝化菌株的生物安全性進行了研究[11]，而未經生物安全性檢驗的菌株在投放使用后極可能對漁業造成危害。此外，現有研究的菌株存在生長緩慢、NH4+-N 耐受性差等問題，不能較好地適應高濃度NH4+-N 的極端環境，如高濃度NH4+-N 的工業和養殖廢水等；缺乏能夠兼用于處理農業、工業廢水的菌株。本研究設計了高濃度NH4+-N 實驗，探索了菌株對濃度范圍較廣 (100～1 000 mg·L-1) 的NH+4-N 的耐受性及去除能力。

為獲得耐高NH4+-N 且安全高效脫氮的好氧反硝化細菌，本文基于一株從廣東省佛山市某羅非魚養殖池塘中分離純化出來的好氧反硝化細菌WM28，對其進行菌株種屬鑒定、抗生素藥敏實驗和毒性實驗，研究了其異養硝化-好氧反硝化的能力及高NH4+-N 耐受性，以期為廢水脫氮提供良好的菌種來源，并為未來該菌種在新型脫氮工藝中的開發利用奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株WM28 篩選自廣東省佛山市某羅非魚養殖池塘采取的池水和底泥。用甘油冷凍保存法將菌株保存于實驗室中，實驗前進行富集培養。

1.2 培養基

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基為：牛肉膏3 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，氯化鈉 (NaCl) 5 g·L-1，瓊脂17 g·L-1，雙蒸水 (ddH2O) 1 L，pH 7.2～7.4；

單一氮源模擬廢水：磷酸二氫鉀 (KH2PO4) 1.5 g·L-1，七水硫酸鎂 (MgSO4·7H2O) 0.2 g·L-1，磷酸氫二鈉 (Na2HPO4) 7.9 g·L-1，檸檬酸鈉 7.169 g·L-1，氯化銨 (NH4Cl) 0.764 g·L-1或硝酸鈉(NaNO3) 1.214 g·L-1或亞硝酸鈉 (NaNO2) 0.986 g·L-1，微量元素溶液 2 mL，H2O 1 L，pH 7.2；

高氨氮模擬廢水培養基在單一氮源模擬廢水(NH4Cl) 的基礎上，改變NH4Cl 和檸檬酸鈉的濃度：NH4+-N 初始質量濃度分別為100、200、500、700 和1 000 mg·L-1，分別加入0.382、0.764、1.911、2.675 和3.821 g·L-1的NH4Cl，分別加入3.584、7.169、17.912、25.090 和35.843 g·L-1的檸檬酸鈉。

1.3 實驗方法

1.3.1 形態學分析

將菌株接種至牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基中，28 ℃培養24 h，肉眼觀察單菌落生長形態；再通過革蘭氏染色在油鏡下觀察菌體的染色特性。用掃描電鏡對分離菌株個體形態進行觀察并拍照記錄。菌株的生理生化特性鑒定根據《常見細菌系統鑒定手冊》[12]及《Bergey's Manual of Systematic Bacteriology》[13]進行。

1.3.2 菌株16SrRNA基因序列分析

使用DNA 提取試劑盒提取菌株WM28 的DNA，并以之為模板擴增其16SrRNA基因。使用的引物為：上游引物 (27 F)：5'-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3'；下游引物 (1 492 R)：5'-GGC TACCTTGTTACGACTT-3'。用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果，并將擴增產物送至上海生工有限公司進行測序。將測序結果先提交到NCBI，在Gen-Bank 中獲得注冊號。使用BLAST 進行序列比對，選取同源性較高的模式菌株，利用MEGA 6 軟件構建系統發育樹，分析菌株的種屬關系。

1.3.3 常見抗生素紙片藥敏實驗

按照我國衛生行業標準WS/T 639—2018《抗菌藥物敏感性試驗的技術要求》中的“紙片擴散法”要求開展常見抗生素紙片藥敏實驗。菌株活化后，取150 μL 菌液于平板上，均勻涂布，待平板晾干后，使用無菌鑷子將含有抗生素的紙片貼于平板中間，重復貼3 個，15 min 內倒置平板。于30 ℃恒溫條件下培養18 h 后，使用游標卡尺測量抑菌圈直徑并記錄。

1.3.4 生態毒性評價—魚類毒性實驗

取出活化培養至16 h 的WM28 菌液，在5 000 r·min-1離心5 min，去上清液，用無菌PBS 緩沖液洗滌沉淀，重復2 次后，再用滅菌水重懸菌體，測定OD600，根據OD600與菌濃度的變化趨勢得到實驗標準曲線。參照Shu 等[14]的方法，選取體長為(3±1) cm 且健康的斑馬魚 (Daniorerio) 60 尾，隨機分配到裝有15 L 淡水的玻璃容器中，每缸10尾，設置3 個重復。實驗組加入WM28 并根據標準曲線控制其菌量在1×106CFU·mL-1，對照組加入等體積無菌水。實驗期間，正常飼養斑馬魚，每隔3 d 對水體進行更換，換水后按上述方法重新加入菌株，實驗持續10 d，記錄斑馬魚的成活率。

1.3.5 菌株在3 種單一氮源模擬廢水下的生長情況與脫氮性能

實驗設置3 種單一含氮模擬廢水 (設置初始NH+4-N、NO-3-N 和NO-2-N 的質量濃度分別為197.06、211.70 和194.04 mg·L-1)，其他變量保持一致，設置不添加菌液的空白對照組，每組實驗設置3 個平行。將活化培養至第16 小時的菌株以體積比1%的接種量，分別接種到3 種高溫滅菌后的單一含N 模擬廢水中，在恒溫搖床中培養48 h；前12 h 每4 h 取樣，后36 h 每8 h 取樣，測定發酵液中的生物量 (以光密度OD600為表征)，再在5 000 r·min-1，5 min 條件下進行離心處理后取其上清液，檢測其NH4+-N、NO3--N 和NO2--N 的濃度，以觀察菌株的生長情況及氮源的動態變化情況。

1.3.6 菌株WM28 對高濃度NH4+-N 模擬廢水的耐受性

為探究菌株是否具備處理養殖尾水、工業廢水的潛力，分別使用NH4+-N 質量濃度為100、200、500、700 和1 000 mg·L-1的模擬廢水對菌株WM28進行培養，其他變量保持一致，每組實驗設置3 個平行。將活化培養至16 h 的菌株以體積分數1%接種量分別接種到不同濃度的NH4+-N 模擬廢水中，在30 ℃恒溫搖床中培養120 h，前72 h 每8 h 取樣，后48 h每12 h 取樣。測定發酵液中的OD600及其NH4+-N 濃度，驗證菌株對高濃度NH4+-N模擬廢水的耐受性。

1.3.7 N 檢測方法及去除率計算

NH4+-N 采用納氏試劑分光光度法 (HJ 535—2009) 測定；NO3--N 采用紫外分光光度法 (HJ/T 346—2007) 測定；NO2--N 采用N-(1-萘基)-乙二胺二鹽酸鹽分光光度法 (GB 7493—1987) 測定。去除率η的計算公式如下：

式中：C0表示第0 小時的相應氮源質量濃度(mg·L-1)；C1表示發酵培養之后某時間測得的相應氮源質量濃度 (mg·L-1)。采用Origin 2018 軟件對實驗結果進行統計分析與繪圖。

2 結果

2.1 菌株的形態、生理生化及16S rRNA 分子鑒定

菌株WM28 在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基上形成米白色菌落，透明、表面光滑濕潤、形狀不規則(圖1-a)。革蘭氏染色結果呈陽性 (圖1-b)。掃描電鏡下，菌株WM28 為長約1.4 μm、寬約0.4 μm 的桿菌 (圖1-c)。根據《常見細菌系統鑒定手冊》[12]和《Bergey's Manual of Systematic Bacteriology》[13]進行菌株的生理生化鑒定，初步鑒定WM28 為赤紅球菌 (表1)。

表1 菌株WM28 生理生化鑒定結果Table 1 Physiological and biochemical identification results of strain WM28

圖1 WM28 菌落形態特征觀察注：a.菌落特征；b.革蘭氏染色鏡檢；c.菌株掃描電鏡圖。Fig.1 Observation on morphological characteristics of WM28 colonyNote: a.Colony characteristics; b.Gram stain microscopy; c.Scanning electron microscope of strain.

將菌株WM28 的16S rRNA 序列上傳NCBI，在GenBank 中獲得注冊號MW578893.1。比對結果顯示 (系統發育樹見圖2)，菌株WM28 與Rhodococcus屬Rhodococcussp.OUZC16 在同一個分支上，親緣關系最近，序列比對一致度為99.64%，故鑒定為紅球菌屬。

圖2 基于 16S rRNA 基因序列菌株WM28 的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain WM28 based on 16S rRNA sequence

綜合形態學、生理生化特征及16SrRNA基因序列和系統發育樹分析結果，鑒定該菌株為紅球菌屬赤紅球菌，命名為RhodococcusruberWM28。

2.2 常見抗生素紙片藥敏實驗及生態毒性實驗

藥敏實驗結果 (表2) 顯示，菌株WM28 對氯霉素、鹽酸四環素、硫酸慶大霉素、左氧氟沙星等常見藥品敏感；對諾氟沙星、環丙沙星呈中介狀態；但對頭孢他啶、鏈霉素等常見抗生素呈耐藥性。這與抗生素的天然抗菌譜相關，實驗菌WM28 為放線菌目、棒桿菌亞目、諾卡菌科、紅球菌屬，頭孢他啶對革蘭氏陽性菌的效果與第一代頭孢菌素近似，作用較弱[15]；鏈霉素產自放線菌目中的鏈霉菌[16]，對菌株不敏感，在實際應用中應避開使用頭孢他啶及鏈霉素等抗生素進行滅菌。因此，推斷菌株WM28 對常見的抗生素具有較好的藥物敏感性。

表2 抗生素耐藥性實驗結果表Table 2 Experimental results of antibiotic resistance

生態毒性實驗中，正常飼養到第12 天時，菌株WM28 實驗組和對照組的斑馬魚成活率均為100%。由于本實驗加入的菌液濃度為1×106CFU·mL-1，高于病原微生物的致病劑量 (1×104CFU·mL-1)，因此可以初步判斷菌株WM28 具有較高的生物安全性。

2.3 菌株在3 種單一氮源模擬廢水下的生長與脫氮性能

菌株WM28 分別在3 種單一氮源模擬廢水中的生長與脫氮性能如圖3 所示。異養硝化培養體系中 (圖3-a)，當NH4+-N 作為唯一的氮源被菌株利用時，菌株WM28 在第12 小時進入對數期，第24 小時達到最大生長OD600(1.004)，培養至第36 小時NH4+-N 被完全去除，表明其具有良好的異養硝化NH4+-N 去除性能；在脫氮前期有6～7 mg·L-1NO3--N 少量生成后被去除，無NO2--N 積累。

圖3 菌株WM28 在單一NH4+-N (a)、NO3--N (b)、NO2--N (c)模擬廢水中的生長及脫氮性能注：初始無機氮質量濃度 (C0,mg·L-1)，NH+4-N 為197.06，NO-3-N 為211.70，NO2--N 為194.04。Fig.3 Growth and denitrification performance of strain WM28 under a single NH4+-N (a),NO3--N (b) and NO2--N (c) simulated wastewaterNote: Initial inorganic nitrogen mass concentration (C0,mg·L-1): NH4+-N 197.06; NO3--N 211.70; NO2--N 194.04.

在單一NO-3-N 的好氧反硝化體系中 (圖3-b)，觀察到顯著的NO3--N 去除，48 h 后去除率為76.3%。菌株WM28 在第24 小時達到最大生長OD600(0.762)，后呈下降趨勢，可能與此時高濃度的NO2--N 相關。在好氧反硝化過程中，NO-3-N 首先轉化為NO-2-N，最大質量濃度為81.20 mg·L-1，最終降至15.61 mg·L-1。推測高濃度的NO2--N 會對菌株WM28 產生毒性，一定程度上抑制其生長和代謝。

在單一NO2--N 的好氧反硝化體系中 (圖3-c)，菌株WM28 培養至第24 小時后達到最大生長OD600(0.705)，48 h 后NO2--N 去除率為66.99%，表明具有良好的好氧亞硝酸鹽去除性能。單一NO3--N 和單一NO2--N 在36 h 后分別檢測到0.909和2.734 mg·L-1的NH4+-N 生成，王田野等[17]認為，Acinetobactersp.SQ2 菌體在利用NO-3-N 或NO-2-N 為氮源生長合成細胞內源N 后，菌體進入內源期后部分內源N 通過氨化作用轉化成為NH4+-N，從而導致水體中NH4+-N 的產生。

異養硝化和好氧反硝化是重要的能量代謝途徑。比較3 種單一氮源的結果，菌株WM28 在反應體系中具有良好的氮源降解效果，異養硝化體系能夠將NH4+-N 完全降解，在生長及脫氮性能上優于好氧反硝化體系。因此，推測該菌株用于去除NH4+-N 的能量高于NO3--N 或NO-2-N，但因能量供應導致的生長及脫氮性能的差異還需進一步的實驗驗證。

2.4 菌 株 WM28 對高濃度 NH4+-N 模擬廢水的耐受性

菌株WM28 在不同濃度的NH4+-N 模擬廢水中的耐受性結果 (圖4，表3)顯示，隨著NH4+-N 質量濃度上升，菌株生長的對數期逐漸延后，OD600最大值逐漸增大。100、200 和500 mg·L-1初始NH4+-N 質量濃度中的NH4+-N 分別在第16、第24和第56 小時被完全去除；700 mg·L-1初始NH+4-N質量濃度中的NH4+-N 在第116 小時后可被去除88% 以上；在第120 小時，菌株WM28 對1 000 mg·L-1初始NH4+-N 質量濃度中的NH4+-N 去除率為74.38%，這說明菌株WM28 具有良好的耐受高濃度NH4+-N 的能力，在初始NH4+-N 質量濃度為1 000 mg·L-1時仍有脫氮能力。

表3 菌株WM28 在不同質量濃度NH4+-N 模擬廢水中培養120 h 后的生長及去除情況Table 3 Growth and removal of strain WM28 in simulated wastewater with different concentrations of NH4+-N for 120 h

圖4 菌株WM28 對高濃度NH4+-N 模擬廢水的耐受性Fig.4 Tolerance of strain WM28 to high concentrations of NH4+-N simulated wastewater

3 討論

3.1 赤紅球菌WM28 的安全性評價

作為天然環保制劑，微生態制劑能有效凈化水質，改善生態環境，提高動物的機體免疫力，故在水產養殖領域的應用較為廣泛[18]。紅球菌屬是用于廢水處理的常見微生物，除了能夠有效降解苯酚、苯乙烯、鄰苯二甲酸酯、芘等有機化合物外，在處理含N 廢水上亦有較好效果[19-21]。例如，張智超等[19]從生豬養殖場篩出的紅球菌菌株ZZC-14 對NH4+-N 的降解率達到94.4%；田雅潔等[20]篩出的玫瑰紅紅球菌XH2 的最高NH4+-N 去除率均在98.0%以上，均能體現紅球菌屬在處理含N 廢水上的巨大潛能。但該屬部分菌種導致生物患病的報道亦令人擔憂，如馬紅球菌 (R.equi) 導致馬駒(Equuscaballus) 患慢性化膿性支氣管肺炎、棒狀紅球菌 (R.kroppenstedtii) 致新生兒菌血癥和關節炎等[22-24]?；谒a健康養殖需要，微生態制劑研發篩選獲得菌株后需要重點關注風險評價與安全性分析[25]。為確保微生物菌劑應用中的生態環境安全和污染防治，本研究對篩選出的赤紅球菌WM28進行了生物安全性評估，證明其是一株具有安全性的好氧反硝化菌株，在工廠化水產養殖領域具有潛在的開發前景。但菌株對抗生素抗性是否具有轉移性或耐藥基因是否存在于菌株的DNA 上，仍需通過質粒提取進行更深入的實驗研究[26]。

3.2 赤紅球菌WM28 的異養硝化-好氧反硝化途徑

有研究表明，紅球菌屬通過完全異養硝化-好氧反硝化途徑除銨[27]。在已有的異養硝化-好氧反硝化細菌的研究中，發現兩種不同的硝化途徑：NH4+-N→NH2OH→NO2--N (?NO3--N)→NO→N2O→N2和NH+4-N→NH2OH→N2O→N2。在菌株WM28 的異養硝化過程中，當以NH4+-N 為唯一氮源時，培養48 h 后脫氮去除率為100%，顯著高于R.erythropolisATCC 4277 的47%[28]，脫氮效果明顯。異養硝化培養基中有NO3--N 少量積累，且無NO2--N 積累，這與Su 等[29]從對蝦養殖池中篩出的菌株GZWN4 的研究一致。本實驗中，菌株WM28 的異養硝化作用與菌株生長幾乎同步進行。異養硝化途徑可能為NH4+-N→NH2OH→NO2--N→NO3--N[30]。而實驗過程中積累的NO3--N 被菌株通過反硝化途徑去除。在菌株WM28 的好氧反硝化過程中，當以NO3--N 為單一氮源時，NO3--N 先轉化為NO-2-N 后，再被去除；以NO-2-N 為單一氮源時，過程中無NO3--N 生成，推測反硝化途徑為NO3--N→NO2--N →NO→N2O→N2。因此，推斷菌株WM28能同時進行硝化和反硝化作用，能夠快速高效進行N 降解，在處理含N 廢水上有巨大的應用潛能。但要驗證菌株的異養硝化-好氧反硝化途徑，還需要克隆菌株硝化、反硝化基因，例如氨氮加氧酶基因 (amo)、羥胺氧化酶基因 (hao)、硝酸鹽還原酶基因 (nap)、亞硝酸鹽還原酶基因 (nir)、氧化亞氮還原酶基因 (nos) 等[31]，以進一步完善N 轉化途徑及代謝機制研究。

3.3 赤 紅球菌WM28 在高NH4+-N 廢水處理中的潛力

在高NH4+-N 廢水處理方面，雖已發現較多去除NH4+-N 的菌株，但紅球菌屬在NH4+-N 質量濃度超過200 mg·L-1的廢水處理上的研究較少[32-34]，且存在耐受力低、應用成本高等問題。以往研究中，Wang 等[33]通過紫外線-硫酸二乙酯復合誘變得到了紅球菌ΔCPZ 24 對100 mg·L-1NH4+-N 的去除率為81.99%，但并未有更高濃度的進一步實驗，且誘變工程菌處理水環境在安全性上存在一定隱患；而張衛藝等[34]使用紅平紅球菌 (R.erythropolis) 處理豬場廢水的NH4+-N 去除率僅為59.35%。本研究的目的是篩選出一株能安全、高效處理工廠化養殖廢水的耐高NH4+-N 環境的新型好氧反硝化細菌。本研究從池塘環境中獲得的赤紅球菌WM28 能在100～500 mg·L-1NH4+-N 質量濃度模擬廢水中完全將其去除，700 mg·L-1NH4+-N 在116 h 后被去除88%以上，在第120 小時對初始NH4+-N 質量濃度為1 000 mg·L-1的廢水仍有脫氮能力，去除率為74.38%。相較于同屬其他降NH4+-N 菌株，WM28在較寬的N 濃度范圍內表現出良好的脫氮能力，擴大了其在廢水處理中的應用?？傊?，赤紅球菌WM28 在處理高NH4+-N 廢水的微生態制劑開發中極具潛力。

4 結論

赤紅球菌WM28 是一株抗生素敏感性高、生物安全性強的天然菌株；在3 種單一氮源模擬廢水條件下培養48 h，NH4+-N 、NO3--N、NO2--N 的去除率分別為100%、76.3%、66.9%；在高質量濃度100～1 000 mg·L-1模擬NH4+-N 廢水條件下的耐受力強，120 h 內NH4+-N 去除率可達74.38%～100%。綜上所述，該菌株對N 濃度適應范圍廣，是一株安全高效的異養硝化-好氧反硝化菌，在處理養殖尾水、工業廢水領域具有較好的應用前景。但開發新型的微生物制劑還需要考慮菌株的穩定性，今后可以對菌株繼續進行固定化研究，使其能以一定比例在漁業生產尾水中持續存在，實現穩定高效且可循環利用的綠色生產。