超聲波輔助提取-高效液相色譜法分析干酪中9種生物胺

張 慧,王 瑾,唐紗麗,肖功年,曹 慧

(1.浙江科技學院 生物與化學工程學院,杭州 310023;2.浙江省產品質量安全科學研究院,杭州 310018)

干酪是乳類在凝乳酶或其他凝乳劑的作用下凝固后排放乳清而得到的固態或半固態食品[1],它的種類眾多,工藝不盡相同,其加工過程中常有微生物參與將糖類轉化成有機酸或由凝乳酶作用使蛋白質凝固[2]。干酪含有豐富的蛋白質,在成熟過程中在微生物分泌的蛋白酶等作用下,產生大量的氨基酸,一方面形成干酪特有的風味和品質[3-4],另一方面微生物產生的酶也會對游離氨基酸產生脫羧基作用而生成生物胺[5]。鹽的含量[6]、pH[7]、成熟溫度和時間[8]等會影響生物胺的形成。干酪中常見的生物胺有色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、精胺和亞精胺等[9-11]。生物胺的活性與生物胺的含量關系較大,少量的生物胺具有多種生理活性[12-14],但攝入過量的外源性生物胺時,有可能產生心悸、頭痛、血壓變化等不良癥狀[15]。

國內外對生物胺的檢測方法有高分辨質譜法[16]、液相色譜-質譜法[17-18]、液相色譜法[19-20]、離子色譜法[21]、氣相色譜-質譜法[22]等,在這些方法中,高效液相色譜法是最穩定、最常用的方法之一。Vieira等[20]采用0.6 mol/L的高氯酸溶液振蕩提取了酸奶中的生物胺,建立了反向高效液相色譜檢測酸奶中生物胺的檢測方法。劉繼超等[23]采用三氯乙酸溶液振蕩提取60 min,連續提取兩次,高效液相色譜法測定了乳制品中的生物胺,生物胺的總量范圍為10.30～34.00 mg/kg。劉蕾等[9]將干酪樣品用0.1 mol/L的鹽酸溶液勻漿提取30 min,重復兩次,且經過pH調整、正丁醇-三氯甲烷溶液反復提取和鹽析等凈化程序,采用高效液相色譜法分析了傳統干酪中的8種生物胺含量。當前,乳制品中生物胺的提取方法多采用振蕩提取或勻漿提取方式,并經過有機溶劑反復提取、鹽析等復雜的凈化過程再衍生化處理,前處理時間較長,操作繁瑣。干酪在加工成熟過程中易形成生物胺且基質復雜,有必要進一步研究適合干酪中生物胺的提取溶劑、提取方式和快速檢測方法。

本研究建立了超聲波輔助提取-高效液相色譜法同時檢測干酪中9種生物胺的測定方法,優化生物胺提取溶劑和超聲波提取條件,可以提高樣品的提取效率,同時簡化樣品凈化過程,縮短前處理時間;并將其應用于市售干酪樣品的測定分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標準品:2-苯乙胺(Phenylethylamine,Phe)、腐胺(Putrescine,Put)、尸胺(Cadaverine,Cad)、組胺(Histamine,His)、酪胺(Tyramine,Tyr)和亞精胺(Spermidine,Spd),純度均大于99%,北京曼哈格生物科技有限公司;章魚胺(Octopamine,Oct)、色胺(Tryptamine,Try)和精胺(Spermine,Spm),純度均大于98%,北京曼哈格生物科技有限公司;丹磺酰氯(Dansyl chloride),上海安譜實驗科技股份有限公司。

試劑:乙腈、正己烷,均為色譜純,德國Merck公司;鹽酸、三氯乙酸、乙醚、丙酮、乙酸、乙酸銨、氫氧化鈉,均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

沃特世Acquity Arc高效液相色譜儀,紫外檢測器2998,美國沃特世公司;FA2004電子天平,上海舜宇恒平科學儀器;Milli-Q超純水儀,美國密理博公司;VORTEX2旋渦混合器,德國艾卡公司;2-16P離心機,德國西格瑪公司;DS-8510DTH超聲波清洗器,上海生析超聲儀器有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 儀器條件

采用沃特世C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)分離,紫外檢測波長254 nm,流動相A為10%乙酸銨(0.01 mol/L,含1%乙酸)/90%乙腈,B為90%乙酸銨(0.01 mol/L,含1%乙酸)/10%乙腈;進樣量為20.0 μL;柱溫為35 ℃;流速為0.8 mL/min。流動相洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.3.2 溶液的配制

標準儲備液的配制:以0.1 mol/L的鹽酸溶液為溶劑配制質量濃度為1 mg/mL的單標儲備液。

混合標準使用液的配制:準確吸取單標儲備液1.0 mL至同一10 mL容量瓶中,用0.1 mol/L的鹽酸溶液定容,配制成質量濃度為100 mg/L的混合標準溶液,冰箱4 ℃保存。

標準系列溶液的配制:吸取混合標準溶液,以0.1 mol/L的鹽酸配制成0.5～50.0 mg/L系列標準工作液。

丹磺酰氯衍生化溶液配制:準確稱取丹磺酰氯,以丙酮為溶劑配制成質量濃度為10 mg/L的標準使用液,冰箱4 ℃保存。

1.3.3 標準品的衍生

分別吸取1 mL生物胺系列標準溶液于10 mL具塞試管中,依次加入飽和碳酸氫鈉1 mL,氫氧化鈉溶液(1 mol/L)100 μL,衍生化試劑1 mL,渦旋振蕩,恒溫箱中60 ℃反應15 min后取出。加入谷氨酸鈉100 μL,60 ℃繼續反應15 min后取出,加入1 mL純水混勻,40 ℃氮吹除去丙酮,5 mL乙醚渦旋提取,吸出上層乙醚層,再提取一次,合并提取液,40 ℃氮吹儀吹干,1 mL乙腈溶解,0.22 μm濾膜過濾后待測。

1.3.4 提取溶劑的選擇

以干酪樣品作為基質添加混合標準溶液,分別采用0.1 mol/L的鹽酸溶液、質量分數為5%三氯乙酸溶液作為提取溶劑,超聲波提取30 min,進行提取溶劑選擇。

1.3.5 超聲時間、溫度的選擇

以干酪樣品為基質添加混合標準溶液,在功率為500 W、溫度為30 ℃時分別超聲5、10、15、30 min,進行超聲時間選擇研究;選擇合適的超聲時間,40 ℃超聲波提取,進行超聲溫度選擇。

1.3.6 樣品提取和衍生

將適量干酪樣品研磨均勻,準確稱取5 g于50 mL具塞離心管中,加入12.5 mL質量分數為5%的三氯乙酸溶液渦旋振蕩2 min,30 ℃超聲波提取15 min,8 000 r/min離心5 min,轉移上清液至另一離心管中,連續提取兩次,合并上清液,濾紙過濾。移取上述濾液5 mL于15 mL離心管中,加入等體積正己烷,渦旋振蕩2 min;靜置分層,棄去上層正己烷層,下層樣液待衍生。

取待衍生試液1 mL,按照1.3.3節中衍生化步驟進行衍生。

1.3.7 方法學驗證

在干酪樣品基質中分別添加低、中、高三個不同水平的混標溶液,按照1.3.6節方法提取,以及1.3.3節的方法衍生;同時做空白對照試驗,考察加標回收率和相對標準偏差。

2 結果與分析

2.1 標準樣品圖譜

按照1.3.1節的色譜條件,試劑的空白色譜圖見圖1,圖中顯示試劑空白在29 min左右有一個明顯的雜質峰。9種生物胺經丹磺酰氯衍生化后色譜峰在35 min內完全分離,如圖2所示,出峰順序依次為色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、章魚胺、酪胺、亞精胺和精胺,各生物胺質量濃度均為25 mg/L,分離效果較好。

圖1 試劑的空白色譜圖Fig.1 Chromatograms of reagent blank

1—色胺;2—苯乙胺;3—腐胺;4—尸胺;5—組胺;6—章魚胺;7—酪胺;8—亞精胺;9—精胺。

2.2 提取溶劑的選擇

食品中生物胺的提取溶劑常用的有鹽酸[9]、三氯乙酸[23]、高氯酸[24]等,本試驗采用0.1 mol/L的鹽酸溶液和質量分數為5%的三氯乙酸溶液提取干酪中的生物胺。結果表明,鹽酸溶液和三氯乙酸均可沉淀蛋白質,但是經過超聲波處理以后,樣品的鹽酸提取液變得較為混濁,離心后溶液仍然混濁且難以過濾,提取液損失較大;而三氯乙酸超聲波提取液離心后溶液較清,易于過濾。因此,選擇質量分數為5%的三氯乙酸溶液作為干酪提取溶劑。

2.3 超聲時間的選擇

超聲波提取是利用超聲波形成的能量聲場對溶液進行聲空化作用來提取目標物質。郭慧[25]采用功率為50 W的超聲波處理生物胺混標60 min,發現超聲波對生物胺沒有破壞作用。本試驗考察了在溫度為30 ℃時超聲時間對不同生物胺回收率的影響,結果如圖3所示。由圖3可知,色胺在5～10 min內隨著超聲時間的延長回收率逐漸升高,超聲10 min時回收率最高,之后有所下降;其余8種生物胺在5～15 min時間內,隨著超聲時間的延長回收率逐漸增大;所有生物胺在超聲15、30 min時,回收率變化趨于平緩,均達到80%左右及以上。綜合考慮,選擇15 min的超聲時間作為以后生物胺的提取時間。

圖3 超聲時間對生物胺回收率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on recovery rates of biogenic amines

2.4 超聲溫度的影響

超聲溫度對提取也會有一定的影響。郭慧[25]優化了水產品中生物胺的超聲波提取條件,超聲溫度50 ℃、超聲時間25 min為最優組合。本試驗采用15 min的超聲時間,考察了30、40 ℃超聲溫度對干酪生物胺回收率的影響,結果如圖4所示。由圖4可知,30 ℃時9種生物胺的回收率在80%～100%之間,40 ℃時回收率較30 ℃時稍有降低。因此,選擇回收率較高、處理溫度相對溫和的30 ℃作為生物胺超聲波提取時的溫度。

圖4 超聲溫度對生物胺回收率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on recovery rates of biogenic amines

2.5 線性方程、檢出限和定量限

分別配制質量濃度為0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0 mg/L系列標準混合溶液,以標準品峰面積為縱坐標,質量濃度為橫坐標,繪制標準曲線。生物胺的線性方程、檢出限和定量限見表2。由表2可知,7種生物胺(Try、Phe、Put、Cad、His、Oct、Tyr)在0.25～50 mg/L范圍內線性關系良好,線性相關系數均在0.996～0.999之間;2種生物胺(Spd、Spm)在0.25～25 mg/L范圍內線性關系良好,線性相關系數分別為0.993和0.995。9種生物胺檢出限為0.38 mg/kg,定量限為1.25 mg/kg。

表2 生物胺的線性方程、檢出限和定量限Table 2 Linear equation, LODs and LOQs of biogenic amines

2.6 加標回收與相對標準偏差

在干酪基質中分別添加低、中、高三個水平的混合標準溶液,選擇優化的條件即質量分數為5%的三氯乙酸溶液提取、超聲時間為15 min、超聲溫度為30 ℃,進行加標回收試驗,生物胺的回收率與相對標準偏差見表3。由表3可知,9種生物胺的平均回收率為76.3%～90.1%(n=3),相對標準偏差為1.09%～7.45%(n=3),這說明本研究提出的方法的重復性和精密度良好,適用于干酪中9種生物胺的測定分析。

表3 生物胺的回收率與相對標準偏差Table 3 Recovery rates and RSD of biogenic amines

2.7 實際樣品的測定

將本研究建立的生物胺測定方法用于市售天然干酪樣品的檢測,干酪樣品中生物胺含量測定見表4。由表4可知,7個樣品中均檢測出不同含量的生物胺,生物胺總含量范圍為2.44～78.1 mg/kg,各類生物胺的含量為未檢出至55.4 mg/kg,不同樣品間生物胺種類和含量均有較大的差異。在這些樣品中共檢測出7種生物胺,腐胺在所有樣品中均被檢出,含量范圍為1.28～7.51 mg/kg。于華寧等[26]在市售的6種Camembert干酪中也均測定出了腐胺。5個樣品中檢出了組胺,含量為1.85～55.4 mg/kg;4個樣品中檢出了亞精胺,含量為1.34～2.86 mg/kg;分別有3個樣品中檢出尸胺和酪胺,各有1個樣品檢出苯乙胺和精胺,所有樣品均未檢出色胺和章魚胺。所測9種生物胺中,含量最高的為樣品2中的組胺55.4 mg/kg,其次為酪胺10.2 mg/kg。干酪中生物胺的產生和含量受微生物、環境因素、貯存時間、干酪種類等多方面因素的影響,其中能夠產氨基酸脫羧酶的微生物是最重要的因素,如乳酸鏈球菌可將組氨酸轉化成組胺,瑞士乳桿菌具有形成酪胺的性能等[27];腐胺則主要由于受精氨酸的脫羧和轉氨基的作用形成鳥氨酸,鳥氨酸再經脫羧作用形成腐胺[28],一些發酵劑或非發酵劑的菌株都可能促使腐胺的生成。當前,歐盟推薦食品中組胺含量不得超過100 mg/kg,酪胺不得超過100～800 mg/kg[29],本試驗所測的這幾種生物胺含量均遠低于推薦限量值。

表4 干酪樣品中生物胺含量測定Table 4 Determination of biogenic amines in cheese samples (mg/kg)

3 結 語

本研究建立了基于超聲波輔助提取干酪中9種生物胺的高效液相色譜快速檢測方法。生物胺在各自線性范圍內線性關系良好,方法回收率高,精密度和重現性好。將本研究提出的方法用于市售干酪樣品分析,不同樣品間生物胺種類和含量差異較大,需持續關注。本研究提出的方法簡化了乳制品中生物胺的提取和凈化流程,提高了分析效率,適合干酪中多種生物胺的快速檢測,可為深入研究乳制品中生物胺形成機制和安全評價提供技術手段。