紫甘薯響應鹽脅迫的轉錄組分析及調控網絡發掘

鞠好慶, 范維娟, 孫 哲, 喬 宇, 李茹月, 陳路路, 陸新露, 張 鵬, 馬秋香*

(1.中國科學院分子植物科學卓越創新中心 植物分子遺傳國家重點實驗室,上海 200032; 2.上海辰山植物園 上海市資源植物功能基因組學重點實驗室,上海 201602; 3.泰安市農業科學院,山東 泰安 271000)

甘薯儲藏根富含淀粉,莖葉可食用,是全球重要的糧食、蔬菜、飼料和工業原料作物,兼具保健作用和藥用價值,綜合利用價值非常高.甘薯具有產量高、穩產性好、耐逆境能力強等諸多優點,可在多種生態環境下種植[1-2].根據聯合國糧農組織(FAO)近10年的統計,我國是全球甘薯種植面積和產量最大的國家,年產量逾5 000萬t.土壤鹽漬化和次生鹽漬化導致可耕地面積大幅度減少,阻礙了農作物的生長,降低了作物的產量,嚴重制約著農業的可持續發展,已成為制約世界灌溉農業可持續發展和影響生態環境的重要因素.鹽堿地在我國分布廣泛,全國約有1億hm2鹽堿地,其面積超過我國陸地總面積的10%[3],并有加劇的傾向,嚴重影響了國家的糧食安全.甘薯根系發達,莖蔓匍匐生長并且再生不定根的能力很強,有很強的抗貧瘠和抗風性能力,可在含鹽量0.5%的鹽漬荒地上栽植[4-5].因此,研究甘薯耐鹽相關的代謝途徑,了解它響應鹽脅迫的分子機制,對于增加土地的利用率和篩選抗鹽甘薯品種具有重要意義.

甘薯為同源異源六倍體(2n=6x=90),基因組高度雜合[6].早期國內外關于甘薯耐鹽性相關的研究主要集中在品種篩選[4-5]和生理指標鑒定方面[7].甘薯基因組測序的完成促進了耐鹽相關功能基因的挖掘和鑒定[6],結合高通量轉錄組分析,為挖掘和鑒定植物的優異功能基因奠定了基礎[8].對鹽脅迫和對照條件下的甘薯二倍體鹽生野生近緣種、紫甘薯進行轉錄組分析,挖掘到大量鹽脅迫響應相關的功能基因[9-10].分析假厚藤與厚藤甘薯耐鹽近緣種的轉錄組發現,MAPK信號通路相關基因和WRKY、ERF(ethylene responsive factor)轉錄因子與耐鹽性正相關[11-12].鹽脅迫的榕薯轉錄組分析表明,淀粉和蔗糖代謝通路、Ca2+通路中的基因受到明顯誘導表達,并且NAM-ATAF1/2-CUC2、ERF等基因表達差異明顯[13].這些轉錄組分析為開展甘薯耐鹽脅迫研究奠定了基礎.

紫甘薯富含花青素和多酚類物質,是目前重要的功能性食品[14-15].為了進一步提高紫甘薯的應用范圍,本研究對日本紫甘薯品種‘Ayamurasaki’進行鹽脅迫處理,對不同時間點樣品的表型和生理指標進行分析測定,并進行轉錄組分析,獲得差異表達基因和代謝通路,分析差異表達的轉錄因子并構建共表達網絡,研究結果可為分析紫甘薯的耐鹽脅迫響應及分子調控機制等提供依據.

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為日本紫甘薯品種‘Ayamurasaki’(綾紫),離體試管苗由中國科學院分子植物科學卓越創新中心薯類生物技術研究組保存.

1.2 方法

1.2.1 鹽脅迫處理選取長勢一致,生長2個月的甘薯盆栽苗,利用200 mmol·L-1NaCl溶液澆灌處理,分別在0、1、6、24 h收獲根系,用于相關生理生化指標的測定和高通量轉錄組分析,每組樣品3個生物學重復.

1.2.2 總RNA提取、cDNA文庫構建、高通量測序總RNA提取、cDNA文庫構建及高通量測序委托華大基因完成.對獲得的原始序列去接頭和低質量序列,組裝獲得轉錄本信息,與參考基因組(http://public-genomes-ngs.molgen.mpg.de/index.html?org=Ipomoea+batatas&db=ipoBat3&hgsid=4735)比對,對獲得的轉錄本進行注釋.

1.2.3 差異表達基因篩選與GO(gene ontology)功能和KEGG路徑(kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway)顯著性富集分析利用DESeq軟件,以差異倍數|log2Fc|>1(Fc為Fold Change)和錯誤發現率(false discovery rate,FDR)<0.001為標準,進行差異表達基因的篩選.將篩選到的差異表達基因進行GO功能注釋和KEGG路徑分析.采用TBtools軟件[16]繪制差異表達基因的表達熱圖,構建轉錄因子調控網絡.

1.2.4 甘薯生理生化指標測定過氧化氫(H2O2)含量測定:取1 g葉片加入10 mL體積分數為0.1%預冷的TCA溶液,冰浴研磨,勻漿液12 000g離心15 min.取1 mL上清,添加1 mL 100 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH為7.0),2 mL KI(1 mol·L-1),搖勻,靜置10 min,于390 nm波長處測定OD值(紫外分光光度計).根據標準曲線求得H2O2含量.

采用氮蘭四唑NBT光化還原法[17]測定葉片超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性.

以3%磺基水楊酸提取葉片的游離脯氨酸(proline,Pro),采用茚三酮法[18]測定其含量.

脂質過氧化的程度以丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量表示,按照文獻[19]的方法測定其含量.

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫下甘薯生理生化指標的測定

鹽脅迫可使甘薯的生理生化指標,如H2O2、SOD、Pro、MDA等發生一系列的變化.200 mmol·L-1NaCl鹽脅迫處理后發現,隨著處理時間的延長,紫甘薯根中H2O2的含量持續升高(圖1a);而SOD的活性則先上升后下降,在6 h到達最高值(圖1b);Pro含量先降后升,在6 h降到最低,24 h已顯著高于對照(圖1c);MDA的含量則逐漸升高(圖1d);各個指標在不同處理時間與對照相比,差異均顯著(處理1 h的Pro含量除外).結果表明,隨著鹽脅迫處理時間的增加,甘薯根部細胞膜受損程度逐漸加劇,體內發生一系列的脅迫響應.

圖中數據為3次重復的平均值±標準差,顯著性差異采用t檢驗,**,***分別為差異顯著(P<0.01)和極顯著(P<0.001).

2.2 差異表達基因的篩選

利用DESeq軟件對差異表達的基因進行篩選,共獲得3 202個差異表達基因,其中877個基因上調,2 325個基因下調.與對照組0 h相比,處理6 h后,基因表達響應最為顯著,297個基因特異性上調,2 079個基因下調;處理24 h后,差異表達基因最少,共計239個;42個基因在3個時間點均呈下調表達趨勢,具體見圖2.

2.3 差異表達基因的KEGG 路徑富集分析

為進一步研究差異表達基因是否參與特定的代謝通路,對其進行KEGG路徑富集分析.結果表明,差異表達基因共涉及117條通路.與0 h相比,鹽脅迫處理1 h涉及106條通路,6 h涉及114條通路,24 h涉及64條通路.取各個處理組富集程度最顯著的10條通路繪制柱狀圖(圖3).當Q<0.05時(Q值是以FDR校正的P值),鹽脅迫1 h時有7條顯著表達的代謝途徑,主要是代謝(ko01100)、苯丙烷生物合成(ko00940)、植物晝夜節律(ko04712)、光合作用(ko00195)等途徑,分別屬于新陳代謝與生物體系統2大類;鹽脅迫6 h有9條顯著表達的代謝途徑,主要是次級代謝物生物合成(ko01110)、代謝(ko01100)、脂肪酸代謝(ko00071)與丙酸代謝(ko00640)等途徑,全部屬于新陳代謝大類;鹽脅迫24 h有14條顯著表達的代謝途徑,主要是次級代謝物生物合成(ko01110)、苯丙烷生物合成(ko00940)、類黃酮生物合成(ko00941)與代謝(ko01100)等途徑,也全部屬于新陳代謝大類.

Fig.2 Comparison analysis of differentially expressed genes (DEGs) at different time points after NaCl treatment

縱軸,富集的通路;橫軸,柱越高代表此通路受鹽脅迫影響越大(下同).

2.4 差異表達基因的GO分析

對差異表達基因進行GO富集分析發現,相對于0 h,鹽脅迫1 h的處理組有184個差異表達基因參與了9個GO功能分類項,其中10個差異表達基因參與“生物學過程”中的1個分類項,123個差異表達基因參與“分子功能”中的3個分類項,65個差異表達基因參與“細胞組分”中的5個分類項;鹽脅迫6 h的處理組有672個差異表達基因參與了28個GO功能分類項,其中125個差異表達基因參與“生物學過程”中的14個分類項,266個差異表達基因參與“分子功能”中的7個分類項,490個差異表達基因參與“細胞組分”中的7個分類項;鹽脅迫24 h的處理組有125個差異表達基因參與了18個GO功能分類項,其中50個差異表達基因參與“生物學過程”中的4個分類項,103個差異表達基因參與“分子功能”中的11個分類項,23個差異表達基因參與“細胞組分”中的3個分類項(圖4).

由圖4知,在“生物學過程”中,“響應脅迫”這一類別受影響極為明顯,此外天冬氨酸家族氨基酸代謝過程也受到明顯影響,可能與逆境下儲存氮元素有關.在“分子功能”中,金屬離子結合等功能受脅迫影響較大,可能與鹽脅迫下,紫甘薯促進陽離子吸收,降低水勢、減少水分析出有關.在“細胞組分”中,微體等膜系統受脅迫影響較大,暗示膜系統在高滲條件下被破壞.

縱軸,富集的GO條目.

2.5 參與“響應脅迫”的差異表達基因趨勢分析

植物在逆境脅迫時會產生脅迫響應,GO富集分析表明,24 h鹽脅迫的樣本中生物學過程“響應脅迫”這一類顯著富集,根據log2Fc對不同種類的基因進行熱圖繪制(圖5).對差異表達的基因分析發現,活性氧(ROS)清除的相關基因、蛋白合成與降解的相關基因、水分脅迫蛋白的相關基因、離子平衡與轉運蛋白的相關基因及信號轉導與調控的相關基因均受到顯著誘導表達(圖5).ROS清除的相關基因均表現出上調趨勢,其中鐵超氧化物歧化酶(FeSOD)和多酚氧化酶(PPO)基因受誘導最為顯著(圖5a).P4H10(prolyl 4-hydroxylase 10)為膠原蛋白合成中的一種關鍵酶,參與蛋白質合成與降解,其基因顯著上調表達.表達泛素化相關蛋白的E2泛素結合酶(ubiquitin-conjugating enzyme,UBC)和E3泛素連接酶(ubiquitin-protein ligase,UBPL)的基因也受到明顯誘導(圖5b).參與水分運輸的水通道蛋白,如質膜內在蛋白基因(plasmamembraneintrinsicprotein1-4,PIP1-4)、液泡膜內在蛋白基因(tonoplastintrinsicproteins1-4,TIP1-4)和小分子堿性膜內在蛋白基因(smallandbasicintrinsicproteins2-1,SIP2-1)等也明顯受到誘導上調表達(圖5c).參與離子平衡與轉運的蛋白LAZ1(lazarus 1)是1個具有DUF300保守結構域的跨膜蛋白[20],在鹽脅迫下基因顯著上調表達(圖5d).表明在鹽脅迫條件下,紫甘薯的細胞內發生了一系列的響應,以適應鹽脅迫造成的傷害.

在參與鹽脅迫響應的信號轉導與調控的相關基因中(圖5e),可以看到有6類共18種轉錄因子出現明顯的差異表達,包括5個ERF、3個MYB(my elob lastosis)、4個WRKY、2個NAC、3個bZIP(basic-leucine zipper)、1個ARF(auxin response factor)類轉錄因子.其中ERF家族以上調為主,MYB家族以下調為主.并且發現,激酶PEPKR2(phosphoenolpyruvate carboxylase-related kinase 2)、MEKK1(MAPK/ERK kinase kinase 1)等表達的基因也顯著上調表達,暗示著它們極有可能正向調控紫甘薯的耐鹽性.

所有基因使用log2Fc值進行比較,并聚類.圖5 參與“響應脅迫”的差異基因表達分析

橙色表示參與信號與調控的核心調控因子,綠色表示具體行使功能的基因;紅色線條表示正相關,線條的寬度與相關性絕對值成正比.皮爾遜積矩相關系數(r)閾值為|r|>0.98.圖6 脅迫響應基因共表達網絡Fig.6 Gene co-expression network of DEGs involved in "response to stress"

對這些顯著表達的差異基因進行基因共表達網絡分析,獲得一個雙核心網絡(圖6).網絡中的基因受鹽脅迫均上調表達.其中NAC家族的NAC74與F-box家族的FBX23位于核心位置,在響應鹽脅迫過程中,可能通過調控單加氧酶MO1(monooxygenase 1)、谷胱甘肽巰基轉移酶GSTT1(glutathione S-transferase T1)、液泡分選受體VSR4(vacuolar sorting receptor 4)、跨膜蛋白家族LAZ1與硫氧還蛋白超家族HCF164(high chlorophyll fluorescence 164)發揮作用.Na+/H+逆向轉運蛋白NHX6(Na+/H+exchanger 6)僅受FBX23的調控,而LAZ1通過與液泡膜ATP合酶組分VHA-A(V-type proton ATPase catalytic subunit A)、陽離子交換蛋白CAX2(cation exchanger 2)相互作用響應鹽脅迫.此網絡為進一步分析甘薯根中鹽脅迫響應調控機制提供了思路.

3 討論

植物耐鹽性是一個復雜性狀,涉及多種細胞代謝活動,受多個基因的調控,其中消除毒害和維持離子平衡在植物的耐鹽調控中具有重要作用.此外,環境和土壤因素強烈影響鹽脅迫相關基因的表達[21].本研究對紫甘薯進行NaCl處理,通過高通量測序檢測基因的差異表達,并對關鍵生物學過程及代謝途徑進行富集分析,建立脅迫響應基因共表達網絡.此研究為紫甘薯的耐鹽調控機理及抗逆遺傳改良提供了參考.

鹽脅迫處理會導致大量ROS的產生,植物則通過ROS的清除應對這種非生物脅迫.ROS,如H2O2等具有雙重作用,在低濃度時,可以作為重要的信號分子,通過誘導細胞內一系列保護和防御基因來保護植物;但它過量積累時,會引起細胞結構和功能的破壞[22-23].鹽處理后,紫甘薯根系中H2O2明顯積累(圖1a),暗示鹽脅迫引發氧化脅迫.超氧化物歧化酶活性逐漸增強(圖1b),暗示ROS清除酶在保護細胞免受鹽損傷方面起重要作用.轉錄組數據也表明,甘薯根部ROS清除相關的基因明顯受到誘導上調表達(圖5a),如過氧化物酶(POD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(ZnSOD和FeSOD)和多酚氧化酶,它們都具有較強的清除氧自由基等毒素的能力,保護細胞不受損傷.其中后兩者的表達最為顯著,推測它們在紫甘薯抗鹽脅迫的響應中發揮更為重要的作用.GO富集分析也表明,與抗氧化相關的通路明顯富集(圖4),其中在“分子功能”顯著表達的21條類別中有8類與氧化還原或抗氧化相關.這也與文獻[24-25]的結果一致,如:擬南芥受鹽脅迫也會導致ROS相關基因轉錄本增加[24];胡楊受鹽脅迫會導致抗氧化酶被激活,NADPH氧化酶(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase)被抑制,以減少ROS[25].另外,Fan等[26]對堿脅迫的棉花進行轉錄組分析發現,次級代謝途徑中有關ROS清除的基因明顯高表達,以消除ROS來提升棉花的耐堿性;Dalal等[27]對鹽脅迫下小麥基因亞型Raj3765進行轉錄組分析發現,它通過上調抗氧化防御基因,如谷胱甘肽過氧化物酶基因(glutathioneperoxidase7,GPX7)、APX3等,顯著提升耐鹽性,促進根系生長.

高鹽和干旱脅迫對植物造成的一個主要傷害是引起滲透脅迫.水通道蛋白(Aquaporin,PIP或TIP)在細胞水分轉運中起重要作用,植物的質膜和液泡膜上都有水通道蛋白.鹽脅迫下,紫甘薯根部有多個水通道蛋白受到顯著誘導,包括PIP1-4、PIP2-3、TIP3、TIP1-4、SIP2-1等,表明水孔蛋白可能通過調控根部水分的運輸響應鹽脅迫(圖5c).將蘋果中的MdPIP1;2基因轉入擬南芥后發現,鹽脅迫下MDA及鈉離子積累較少,轉基因擬南芥表現出較強的耐鹽性[28].在干旱或鹽分條件下,參與細胞滲透保護的脅迫響應基因在ZmPIP1;1過表達植物中上調表達,過表達植株的抗旱性和耐鹽性增強[29].而在擬南芥中過表達大豆GsTIP2;1基因則會抑制擬南芥對鹽和脫水脅迫的耐受性[30].這些研究證實了水通道蛋白在鹽脅迫響應中發揮不同的作用[28-30].

植物對逆境脅迫的適應性反應之一是維持正常的蛋白質合成與降解.水稻中過表達OseIF-1(eukaryotictranslationinitiationfactor1)可調節離子積累和細胞內氧化還原狀態,從而提升轉基因植株的耐鹽性[31].泛素和泛素結合蛋白在逆境條件下通過蛋白酶的作用來降解受損傷的蛋白質,增強植物對鹽脅迫的抵抗能力[32-33].具有泛素受體和轉運蛋白功能的OsDSK2a(dominantsuppressorofKAR2)在鹽脅迫下表達受抑制,其通過影響GA(gibberellic acid)代謝抑制植物生長[34].鹽脅迫處理紫甘薯后,翻譯起始因子eIF5A2、延伸因子LOS1(low expression of osmotically 1)、泛素相關蛋白酶E1泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme,UBA1)、膠原蛋白合成關鍵酶P4H10等相關基因受誘導顯著上調表達(圖5b).推測甘薯可能通過增加蛋白質的合成能力和迅速降解受損和變性的蛋白來達到抗鹽的目的.

鹽脅迫使植物質膜受到破壞,大量的Na+涌入細胞,也破壞了植物體內原有的電勢平衡.植物獲得耐鹽性的一個很重要的策略就是在脅迫條件下重建離子平衡.各種離子運輸蛋白是重建離子平衡的決定因素.植物質膜H+-ATPase、液泡膜H+-ATPase、P-type ATPase和H+-PPase均具有維持細胞質內pH值穩定、為細胞吸收和轉運營養物質及離子提供質子驅動力的生理功能,Na+的外排和區隔化也都依賴跨膜電化學勢梯度提供能量.本研究中的轉錄組結果表明,鹽脅迫條件下,參與離子平衡與轉運的基因NHX6和跨膜蛋白基因LAZ1表達顯著上調,而高親合性K+轉運蛋白基因(high-affinityK+transporter,HKT6)表達明顯下調(圖5d).Fan等[35]研究發現,甘薯中共表達擬南芥來源的Na+/H+逆向轉運蛋白基因NHX1可以顯著提升甘薯的抗鹽脅迫能力及產量,這與本研究結果一致.在棉花植株中,沉默GhNHX3D的表達可增加葉片、莖和根中Na+的水平,降低根系中K+的含量,提高鹽的敏感性[36].Oh等[37]對正常和鹽處理的冰花表皮鹽泡細胞進行轉錄組分析,發現高親合性K+轉運蛋白HKT1和同源KT1表達的基因在鹽脅迫過程中受誘導下調表達.一般而言,HKT蛋白會將植物體內木質部汁液的Na+外排,以降低鹽脅迫對植物的傷害;然而,大麥HvHKT1;5干擾株系比野生型耐鹽性提升,Na+從根部運輸減少,K+/Na+濃度更大[38].玉米中的ZmLAZ1-4作為鋅轉運蛋白調節鋅的穩態[39],這也暗示IbLAZ1極有可能參與某種金屬離子的轉運,從而促進甘薯對于鹽脅迫的抵抗.

植物中的多種轉錄因子在抗鹽脅迫等各種生理活動中具有重要的作用.bZIP蛋白不僅參與種子貯藏基因的表達、光形態的發生以及器官建成的控制,而且還參與植物對脫落酸(ABA)、逆境脅迫、光和發育中各種信號的反應.在脅迫條件下,bZIP轉錄因子可以與ABA誘導基因啟動子區域的ABRE(ABA-responsive element)結合來調節下游靶基因的表達[40].在小麥中,TabZIP15可能與烯醇化酶TaENO-b(Triticumaestivumenolase-like b)進行互作,參與糖酵解和糖異生途徑的調節,從而提高小麥的鹽脅迫耐受性[41].本文轉錄組分析結果表明,bZIP1、bZIP4和bZIP1-2等多個bZIP蛋白基因受誘導表達(圖5e),表明bZIP蛋白在紫甘薯的鹽脅迫響應中起重要作用.鋅指蛋白不僅對植物的發育起重要調節作用[42],而且對植物抵抗逆境脅迫起關鍵作用.研究發現,鹽脅迫下擬南芥、水稻及棉花中的鋅指蛋白基因表達量增加[43-44].WRKY是一類含有鋅指結構的轉錄因子,大量研究集中于WRKY在病菌侵染時的功能分析[45],也有研究發現,WRKY家族能對生物和非生物脅迫產生應答,在干旱和鹽脅迫反應中起作用[46].番茄SlWRKY8可能通過誘導DREB2A(dehydration-responsiveelementbinding)和AREB(ABAresponsiveelementbindingprotein)等基因的表達,提升植株的耐鹽性.鹽脅迫下水稻基因OsWRKY54在根中快速高表達,其缺失導致地上部Na+積累量增加,水稻植株對鹽脅迫的敏感性增強[47].在甘薯鹽脅迫的樣本庫里(圖5e),WRKY的表達發生了顯著變化,暗示著WRKY在甘薯鹽脅迫響應過程中起作用.MYB類轉錄因子是一類非常重要的轉錄因子,大量存在于植物中,是植物轉錄因子中最大的家族之一,它們通過參與多種基因的轉錄調節,在植物的生長發育、生物和非生物脅迫反應等過程中發揮著重要的作用[48-49].苦蕎麥(Fagopyrumtataricum(L.) Gaertn.)的基因FtMYB22通過ABA依賴途徑抑制多種生理生化反應,減弱植物耐鹽與耐干旱能力[50].本研究顯示鹽脅迫下,紫甘薯根部的MYB類轉錄因子下調表達,推測其可能在甘薯脅迫響應中起負調控作用.

擬南芥中F-box蛋白家族EST1(Enhancedsalttolerance1)基因突變后顯示出耐鹽表型,與野生型相比,NaCl處理后Na+含量顯著降低,Na+/H+逆向轉運蛋白活性更高[51].在擬南芥中過表達甘薯的NAC3基因,可通過ABA途徑與泛素化來增強植株的耐鹽性[52].轉錄因子共表達網絡表明,NAC家族的NAC74與F-box家族的FBX23位于核心位置(圖6),推測它們通過調控參與氧化還原的基因GSTT1和參與離子平衡與轉運的基因VHA-A、LAZ1等,從而正向調控紫甘薯的耐鹽性.

4 結語

本文對紫甘薯進行鹽脅迫處理,分析其生理指標的變化,通過高通量測序鑒定差異表達基因,分析了KEGG路徑與GO富集通路,并對“響應脅迫”中的差異表達基因進行深度挖掘,鑒定在鹽脅迫過程中顯著表達的基因并構建網絡,為進一步探究紫甘薯耐鹽分子機制和挖掘耐鹽關鍵基因提供了理論依據.

感謝上海辰山植物園楊俊博士在原始數據分析過程中給予的大力幫助.