豬胸膜肺炎放線桿菌新疆株分離鑒定及生物學特性研究

張雪麗,張金江,王宏圖,冷婧,趙穎婕,胡建軍,敖維平*

(1 塔里木大學生命科學與技術學院,新疆 阿拉爾 843300)(2 阿圖什市動物衛生監督所,新疆 阿圖什 845350)(3 塔里木大學動物科學與技術學院,新疆 阿拉爾 843300)

豬傳染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)又稱為豬接觸傳染性胸膜肺炎,是一種能引起豬高度接觸性的呼吸道傳染病,其病原為豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP),舊稱胸膜肺炎嗜血桿菌(haemophiluspleuropneumoniae)或副溶血嗜血桿菌(H.parahaemolyticus)。該病主要表現為高度傳染性、致死性,已成為危害養豬業健康發展的重要疫病之一[1-2]。世界各養豬國家均有此病的報道,我國于1987年首次在國內發現本病存在。

根據APP在培養基上生長是否依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD),可將其分為生物Ⅰ型(NAD依賴型)、生物Ⅱ型(非NAD依賴型)2種生物型。其中,生物Ⅰ型具有極強的溶血活性和細胞毒性,毒力強,危害大;與金黃色葡萄球菌一起培養時,可為其提供必需的生長因子。根據莢膜多糖、LPS的抗原差異性,APP可分為19個血清型[3-4],不同血清型菌株的毒力存在差異,其中1、5、9及11型毒力最強,3、6型毒力弱[5]。APP血清型1型是最近頻繁報道的血清型,毒力強,危害大。

國內多位學者報道了APP血清型及其流行情況,APP血清型主要包括1、2、3、4、5、7、8、9、10型,但不同地域血清型可能存在差異,血清型的感染率也存在差異[6-7]。2007年,韓文星等[8]從新疆某豬場分離到APP并進行了部分生物學特性研究,但未確定APP血清型。2012年,王忠山等[9]在新疆北疆某墾區64個規模豬場進行了部分豬疫病血清學調查,發現APP存在與其他疫病混合感染且感染率高的情況。2019年,鄭培等[10]在新疆昌吉市和奇臺縣規?；i場分離得到APP血清型5型菌株,該菌株已成為新疆流行的優勢菌株。在國外,STRINGER O W 等[3]通過APP血清型19型特異性引物對來自不同地區的病豬進行了豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌鑒定,其中來自丹麥的菌株7213384-1豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌被建議作為血清型19型的參考株。

目前,世界上不同國家及地區APP流行菌株的血清型、生物型、流行率不盡一致,同時各血清型間交叉保護力弱[2]。另外,APP對抗菌藥出現耐藥性或多重耐藥性的現象,給該病的預防、治療、凈化等帶來了一定的難度。因此,對APP進行細菌分離鑒定、血清型分型、藥敏試驗等尤為必要。新疆南疆某規模豬場疑似爆發APP,為減少養殖場的經濟損失,本試驗通過臨床剖檢、病理觀察、細菌分離培養、生化試驗、PCR鑒定以及藥敏試驗和動物致病性試驗來確定該疾病病原、血清型及耐藥性,為PCP的防治、疫苗選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源

2021年9月中旬,新疆南疆某規模豬場3 d內連續死亡10頭體重約50 kg的4～5月齡育肥豬,病程短,病豬體溫升高。病理觀察見胸腔有明顯的纖維素滲出,肺與胸膜粘連,肺臟腫大、變性、出血、淤血,耳朵發紺,口鼻流涎帶有血絲。經獸醫流行病學調查得知該豬場有引進后備種豬的記錄史,初診為疑似豬傳染性胸膜肺炎。無菌操作采集發病死亡豬的肺臟、淋巴結等組織病料,低溫保存并進行實驗室檢測。

1.1.2 主要試劑

胰酪胨大豆瓊脂培養基(TSA-YE)、胰蛋白胨大豆酵母肉湯培養基(TSB-YE)、細菌微量生化反應管均購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)購自北京索萊寶科技有限公司;BHI培養基購自北京奧博星生物技術有限責任公司;抗生素藥敏試驗紙片購自杭州微生物試劑有限公司;2×Taq PCR MasterMix、DL-2 000 Marker購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 引物

apxI、apxⅡ、apxⅢ、apxIV基因特異性引物、血清型分型引物借鑒文獻[3-4,11-14](如表1、表2所示),所有引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 APP apx基因特異性引物

表2 APP血清型PCR鑒定引物

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌分離

無菌采取病料接種于含10 μg/mL NAD的TSA-YE瓊脂培養基和不含NAD的TSA-YE瓊脂培養基、巧克力瓊脂培養基、綿羊血瓊脂培養基,37 ℃培養24～48 h。觀察劃線細菌生長狀況及菌落形態,挑取疑似菌落進行革蘭氏染色鏡檢,觀察其形態特征。挑取單菌落接種于BHI液體培養基中培養16～18 h,觀察細菌生長狀況。

1.2.2 NAD依賴試驗

挑取單菌落分別劃線接種于NAD陽性(10 μg/mL NAD,5%牛血清)、NAD陰性(不含有NAD,5%牛血清)的TSA-YE瓊脂培養基。置于37 ℃恒溫培養箱培養18～24 h,觀察菌落生長情況。

1.2.3 “衛星”現象試驗

將分離株在含5%新鮮綿羊血的TSA-YE瓊脂培養基上連續劃線,再用金黃色葡萄球菌劃一直線,垂直(不相交)于金黃色葡萄球菌劃線接種分離的APP,37 ℃培養18～24 h。

1.2.4 CAMP 試驗

用金黃色葡萄球菌在含5%新鮮綿羊血的TSA-YE培養基上劃一橫線,在此橫線下方約0.3～0.5 cm處,用NAD陽性APP分離菌株垂直劃線接種,但不接觸橫線,37 ℃培養18～24 h。

1.2.5 生化試驗

挑取分離株純培養物接種于細菌微量生化反應管,37 ℃培養18～24 h。明膠生化反應若在18～24 h為陰性,可繼續培養18～24 h,轉冰箱2～8 ℃培養30 min,觀察結果。

1.2.6 APP分離株PCR鑒定

分離菌株經apxIV特異性引物(見表1)進行PCR擴增,PCR反應體系(25 μL)為2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,10 μmol/L上下游引物各1 μL,模板1 μL,ddH2O補充至25 μL。PCR反應條件為94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共30個循環;72 ℃ 10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物,回收陽性PCR產物,送上海賽恒生物科技有限公司測序。

1.2.7 APP血清型分型PCR鑒定

根據APP種的PCR鑒定結果,以APP血清型分型引物(表2)進行PCR鑒定,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物,回收陽性PCR產物,送上海賽恒生物科技有限公司測序。

1.2.8apx毒力基因PCR鑒定

以apx毒力基因特異性引物(見表1)進行PCR檢測,PCR反應體系為25 μL,PCR反應條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共30個循環;72 ℃ 10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,回收陽性PCR產物,送上海賽恒生物科技有限公司測序。

1.2.9floR耐藥基因PCR檢測

floR耐藥基因引物[15]floR-F:5′-CGACGCCCGCTATGATCCAACTC-3′,floR-R:5′-CCCAAAAAGCCGGACTCGCGAAG-3′。PCR反應體系(25 μL):2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,2種引物各1 μL,模板2 μL,ddH2O補充至25 μL。PCR反應條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,63.5 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共30個循環;72 ℃ 10 min。目標片段長度約510 bp。

1.2.10 藥敏試驗(K-B紙片法)

用PBS將菌液濃度調至含菌量約1.5×108CFU/mL[16],取200 μL涂布于含NAD的TSA-YE培養基上,無菌操作將藥敏片貼在培養基上,37 ℃培養18～24 h,測量每個藥敏紙片抑菌圈的直徑大小。根據杭州微生物試劑有限公司《藥敏實驗紙片法的抑菌范圍解釋標準》中嗜血桿菌的藥敏紙片抑菌標準判定結果。

1.2.11 動物致病性試驗

20只小鼠隨機分為2組(試驗組、對照組),每組10只,試驗組10只小鼠接種細菌的劑量為1.5×109CFU/只,對照組接種同體積的生理鹽水。接種后觀察并記錄各組小鼠臨床癥狀,發病和死亡時間及數量,剖檢變化。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀和病理學觀察

臨床觀察見病豬精神沉郁、咳嗽、高熱和腹式呼吸等癥狀。急性發病豬可見鼻孔流血、耳朵發紺,口鼻流涎帶有血絲,快速死亡。剖檢死亡豬只,肺臟兩側邊緣出現紫紅色,肺臟淤血、充血,呈現紫紅色,肺表面覆蓋一層黃色纖維素性滲出物,肺與胸壁、縱隔呈纖維素性粘連(如圖1所示)。胸腔內大量積液,呈現典型的纖維素性出血性胸膜肺炎癥狀。腹股溝淋巴結、肺淋巴結和腸系膜淋巴結腫大(如圖2所示)。

圖1 纖維素性粘連

圖2 腸系膜淋巴結腫大

2.2 細菌分離結果

在含10 μg/mL NAD的TSA-YE培養基、巧克力瓊脂培養基、綿羊血瓊脂培養基上均可見圓形隆起、光滑、半透明、直徑為1～2 mm的濁白色小菌落(如圖3所示)。在綿羊血瓊脂培養基中產生β溶血。

圖3 APP菌落形態

革蘭染色鏡檢可見革蘭陰性小球桿菌(如圖4所示)。不含NAD的TSA-YE培養基上細菌生長不良,甚至無菌落生長。

圖4 APP菌體形態(革蘭染色,1 000×)

2.3 NAD依賴試驗及“衛星”現象試驗結果

分離株在含有NAD的TSA-YE培養基上均生長良好,而在不含有NAD的培養基上不生長。在TSA-YE培養基上呈典型“衛星”現象,越靠近金黃色葡萄球菌處,分離株菌落生長越大,反之越小,甚至不見菌落生長;與生物Ⅰ型APP的生長特征一致(如圖5所示)。

圖5 分離株“衛星”現象

2.4 CAMP試驗結果

APP能產生CAMP因子,可促進金黃色葡萄球菌β-溶血素活性。在血瓊脂平板上2種細菌交界處溶血能力增強,形成箭頭狀的溶血區(如圖6所示)。

圖6 分離株CAMP試驗現象

2.5 生化試驗結果

分離菌株生化試驗結果:葡萄糖、蔗糖、乳糖、鼠李糖、蜜二糖、阿拉伯糖,甘露醇、肌醇、山梨醇和VP反應等均呈陰性;脲酶、硫化氫、吲哚、明膠生化反應呈陽性,符合豬胸膜肺炎放線桿菌的生化特性。

2.6 PCR鑒定結果

APPapxIV通用引物可PCR擴增出約346 bp的目的片段(圖7),與預期目的條帶大小一致。利用APP血清型分型引物,其中,APP血清型1型引物可PCR擴增出約754 bp的目的片段(圖8),而其他APP血清型分型引物未擴增出目的條帶,特別是APP血清型19型特異性引物也未擴增出目的條帶。利用apxI、apxⅡ、apxIV的特異性引物,對APP分離株進行PCR擴增,分別獲得了826 bp、1 069 bp、346 bp的目的片段,而apxⅢ基因特異性引物進行PCR反應未擴增出目的片段(圖9)。floR基因檢測引物可PCR擴增出約510 bp的目的條帶(圖10)。

M:DL-2 000 DNA相對分子質量標準;1:陰性對照;2:apxIV PCR產物。

M:DL-2 000 DNA相對分子質量標準;1:陰性對照;2:APP血清型19型PCR產物;3:APP血清型1型PCR產物。

M:DL-2 000 DNA相對分子質量標準;1:陰性對照;2:apxI PCR產物;3:apxⅡ PCR產物;4:apxⅢ PCR產物;5:apxIV PCR產物。

M:DL-2 000 DNA相對分子質量標準;1:陰性對照;2: floR PCR產物。

2.7 核苷酸同源性分析

采用apxIV基因特異性引物進行PCR鑒定,測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST比對分析,與APP參考株(GenBank登錄號:AF021919、AF188859、HM021153、AF188861)核苷酸同源性達99.7%以上。確定該分離株為APP,命名為APP-7T-1。

用APP血清型分型引物對APP-7T-1分離株進行PCR鑒定,僅APP血清型1型引物PCR擴增出目的條帶。經測序、BLAST比對,分離株與APP血清型1型參考株(GenBank登錄號:AF021919)核苷酸同源性達100%。同時,采用APP血清型19型特異性引物[3]進行PCR鑒別,沒有擴增出目的條帶,進一步證實APP-7T-1分離株為APP血清型1型,而不是APP血清型19型。

apxI、apxⅡ、apxIV、floR基因經PCR擴增、測序、BLAST比對,與APP參考株核苷酸同源性均達99.5%以上。

2.8 藥敏試驗結果

用APP-7T-1分離株對喹諾酮類(環丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星)、β-內酰胺類(頭孢噻呋、頭孢唑林、頭孢拉定)、氨基糖苷類(卡那霉素、慶大霉素、丁胺卡那、氨芐西林、青霉素)、大環內酯類(紅霉素、阿奇霉素)、四環素類(四環素、多西環素)、磺胺類(復方新諾明)、酰胺醇類(氟苯尼考)等進行藥敏試驗,結果顯示,APP-7T-1分離株對喹諾酮類(環丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星)具有敏感性,對其他藥物不敏感或低敏感(表3)。

2.9 動物致病性試驗結果

試驗組小鼠均表現出反應遲鈍,閉眼縮脖,呆立角落,被毛扎立,活動停止,3 d內全部死亡,剖檢可見肺臟彌散性出血、脾臟腫大等癥狀。無菌采集發病死亡小鼠肺臟、脾臟,均可分離出豬胸膜肺炎放線桿菌,空白對照組小鼠全部正常(圖11)。

A:試驗組致病小鼠;B:對照組正常小鼠。

3 討論

當前國內尚未有對APP血清型19型的公開報道,因此,本研究在鑒定APP血清型1、2、3、5、6、7、8、12型的基礎上,還開展了對血清型19型的鑒定。通過鑒定,確認了本次新疆南疆發病豬場發生的是APP血清型1型。據流行病學調查,該豬場發病前2個月曾從北疆某豬場引進后備種豬,此次發病是否與引種有關系,仍需做進一步研究。本研究結果與公開報道的新疆南、北疆鑒定的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清型存在差異,因此以何種血清型為主要流行優勢菌株仍需要做大量的流行病學調查。

APP的毒力因子有多種,如溶血外毒素(Apx)、菌毛、莢膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、轉鐵結合蛋白、蛋白酶、黏附因子等。其中,溶血外毒素是APP導致豬發病的主要毒力因子。盡管脂多糖能引起肺部炎性細胞滲出,但不足以誘發胸膜肺炎的特征性病變。而溶血外毒素是本菌最重要的毒力因子,不同APP的血清型菌株可產生4種不同的細胞毒素,分別為ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ、ApxⅣ。這些毒素具有細胞毒性或溶血性,是一種穿孔毒素,屬于含重復子毒素(repeats-in-toxin,RTX)家族[5]。不同的APP血清型含有的毒素不盡相同,APP血清型中1、5、9、11型可產生ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅣ。ApxⅠ毒素具有很強的溶血活性、細胞毒性,而ApxⅡ毒素、ApxⅣ毒素則相對較弱。本研究中分離株被鑒定為APP血清型1型,且檢測到分離株中含有apxⅠ、apxⅡ、apxⅣ基因,致病性試驗中該分離株可引起試驗動物發病、死亡,證實該分離株具有致病性。

氟苯尼考(florfenicol,FFC)是用于APP治療的常用抗生素藥物之一,不同地域分離獲得的APP分離株耐藥性存在一定的差異。近年來臨床上已檢測到其相關耐藥基因floR[17],給APP的治療帶來一定難度。本研究中藥敏試驗結果顯示,分離株對氟苯尼考具有耐藥性,同時,在分離株中檢測出floR耐藥基因,耐藥基因的檢出與藥敏試驗結果基本一致。

目前,免疫接種疫苗依然是APP防控的重要手段之一,由于地域差異、血清型不同,各型間交叉保護力存在差異,因此,選擇合適疫苗顯得尤為重要。對于已感染豬場或流行率較高的豬場,幸存豬多半為帶菌豬,很難控制,因而豬場在引種時應十分謹慎,杜絕從疫區引種,最好從疫苗接種完全、從未發病的豬場引種。

4 結論

經病原學、分子生物學鑒定分析,證實該豬場發病死亡豬主要是由APP所致,且該分離株為生物I型(依賴NAD)、血清型1型豬胸膜肺炎放線桿菌。