特應性皮炎生物標志物鑒定及其免疫浸潤研究

朱玉珍,吳紫薇,高貽宙,Ulf Meyer-Hoffert,吳志宏,

(1.浙江科技學院 生物與化學工程學院,杭州 310023;2.德國基爾大學 醫學院皮膚學研究所,德國 基爾 24105)

特應性皮炎(atoipc dermatitis,AD)是一種慢性、炎癥性、復發性皮膚病。特應性皮炎患者會出現濕疹性病變并伴隨強烈的瘙癢,從而導致失眠和心理健康問題[1]。AD患者的先天免疫和適應性免疫都發生了改變,導致病菌感染,從而觸發和加重疾病進程?，F有研究表明,AD中與免疫功能障礙相關的發病機制包括:免疫球蛋白E(immunoglobulin E,lgE)增加,對過敏原的敏感性增加,急性病變中Th2型細胞因子表達升高,表達皮膚淋巴細胞相關抗原的T細胞數量增加,朗格漢斯細胞和炎性樹突狀表皮細胞上高親和力IgE受體的表達增加,胸腺基質淋巴細胞生成素的表達增加[2-4]。除此以外,研究還發現,多種免疫細胞參與AD的調控,如自然殺傷細胞、巨噬細胞、肥大細胞、B細胞等[5-7]。然而,AD的免疫病理學機制仍然不明確。因此,評估AD免疫細胞浸潤程度,探索潛在相關標志物免疫細胞類型相對豐度的變化,對進一步闡明AD的分子機制,開發新的免疫治療靶點具有重要意義。

基因表達綜合數據庫(Gene Expression Omnibus,GEO)是目前最大、最全面的公共基因表達數據庫,存儲了大量的測序數據。目前,已有多項研究通過下載公共數據庫的數據來分析疾病的生物標志物,如楊雷等[8]對骨關節炎免疫機制的探索和李娜等[9]對潰瘍性結腸炎免疫細胞的浸潤模式的研究。機器學習算法是一種人工智能技術,它通過構建自動學習系統對未知數據進行預測、分析。機器學習已經越來越多地應用于疾病預測、診斷和預后及藥物發現[10]。因此,本研究使用機器學習算法來綜合篩選與AD相關的生物標志物。此外,我們還使用通過估計RNA轉錄物的相對亞群鑒定細胞類型(cell-type identification by estimating relative subsets of RNA transcripts,CIBERSORT)算法研究了生物標志物和免疫浸潤細胞之間差異的變化,以更好地了解AD所涉及的分子免疫機制,為進一步研究提供方向。

1 材料及方法

1.1 數據來源

在GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)檢索與AD相關的數據集,篩選標準為:數據集既包含正常對照皮膚樣本又包含AD患者皮膚損傷樣本;所有納入樣本均未進行藥物處理。最終篩選出4個數據集:GSE32924、GSE130588、GSE16161和GSE36842,這4個數據集均為GPL570測序平臺。利用數據處理軟件RStudio對數據集進行了預處理。根據平臺的注釋文件將探針轉換為基因名,排除與基因符號不對應的探針。將GSE32924和GSE130588、GSE16161和GSE36842分別合并,并進行批次矯正;其中GSE32924、GSE130588作為訓練集,GSE16161、GSE36842作為驗證集。

1.2 篩選DEG

利用RStudio篩選訓練集的差異表達基因(differentially expressed gene,DEG),閾值設置為|log2tFC|>2、p<0.05。

1.3 生物標志物的篩選與驗證

采用機器學習方法篩選出關鍵的DEG作為AD的生物標志物。最小絕對收縮和選擇算子回歸分析(least absolute shrinkage and selection operator,LASSO)算法通過添加懲罰函數,將不重要的回歸系數直接縮減為0,從而達到特征選擇的目的[11]。支持向量機遞歸特征消除特征選擇(support vector machine-recursive feature elimination,SVM-RFE)算法采用風險最小化原則和經驗誤差最小化原則,可用于提高學習性能以過濾模型[12]。隨機森林(random Forest,RF)算法通過對對象和變量進行抽樣構建預測模型,生成多個決策樹并依次對對象進行分類,最終將分類樹結果進行匯總,從而實現降維的目的[13]。RF算法通過基尼指數計算每個變量對分類樹每個節點上觀測值異質性的影響,從而比較變量的重要性。本研究利用RStudio構建上述3種機器學習算法,并選擇重疊基因做進一步分析。

將GSE16161和GSE36842合并作為驗證集,構建受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線以評估生物標志物的預測價值。ROC曲線下的面積(area under ROC curve,AUC)反映了診斷價值的大小,面積越大,越接近1,診斷準確性越高;若越接近0.5,則診斷無意義。

1.4 免疫浸潤細胞分析

CIBERSORT算法基于線性支持向量回歸的原理進行反卷積分析,可用于評估AD患者的免疫細胞浸潤情況[14]。CIBERSOFT算法基于蒙特卡洛(Monte Carlo)采樣來獲得每個樣本的反卷積p值。保留p<0.05的數據,運用RStudio分析正常對照皮膚樣本和AD患者皮膚損傷樣本之間免疫細胞浸潤的差異變化。然后進行免疫細胞的相關性分析,用相關系數r表示兩個系數之間的相關性。r為正時表示正相關,r為負時則表示負相關;r越接近1則兩個變量之間的相關性越高。

1.5 生物標志物與免疫浸潤細胞的相關性分析

使用RStudio對篩選到的生物標志物和免疫細胞進行相關性分析,以進一步探索AD疾病發展過程中的免疫機制。

2 結 果

2.1 差異基因篩選

GSE32924與GSE130588合并后共得到28個健康樣本(對照組),64個AD樣本(試驗組),差異分析共篩選得到159個差異基因,包括54個上調基因和105個下調基因。

2.2 生物標志物的篩選

使用3種不同的機器學習算法來篩選關鍵的DEG作為AD的生物標志物,篩選結果如圖1所示。LASSO算法識別了16個基因(圖1(a))。SVM-RFE算法篩選出28個基因(圖1(b))。此外,利用RF算法對基因的重要性進行排序,篩選基尼指數大于2的基因,共得到6個基因(圖1(c))。對3種機器學習算法篩選出來的基因取交集,最終得到2個重疊的基因:基質金屬肽酶12(matrix metalloproteinase 12,MMP12)和WNT(wingless/integrated,無翅/整合素)抑制因子1(WNT inhibitory factor 1,WIF1)(圖1(d))。

圖1 特應性皮炎生物標志物的篩選Fig.1 Screening biomarkers for patients with atopic dermatitis

構建MMP12、WIF1的ROC曲線,并利用AUC值來確定正常對照皮膚樣本和AD患者皮膚損傷樣本的診斷有效性,結果見圖2。由圖2(a)和(b)可知,MMP12、WIF1在測試集中的AUC值分別為0.982、0.956,表明這兩個生物標志物具有較高的預測價值。為了進一步驗證MMP12、WIF1作為AD診斷標志物的潛力,對合并的GSE16161和GSE36842中的這些基因進行了ROC分析,繪制了ROC曲線(圖2(c)和(d)),結果也證明兩個基因可以作為AD的潛在生物標志物。

圖2 MMP12、WIF1在測試集與驗證集中的ROC曲線及AUC值Fig.2 ROC curve and AUC value of MMP12 and WIF1 in test set and verification set

2.3 生物標志物與免疫浸潤細胞相關性分析

采用CIBERSORT算法計算數據集中22種免疫細胞的浸潤豐度矩陣。由于樣本中單核細胞缺失,所以去除單核細胞,用21種免疫細胞做后續分析,結果如圖3所示。圖3(a)展示了21種免疫細胞在各樣本中的含量分布,同時通過小提琴圖較為直觀地展現了正常皮膚樣本和AD患者皮膚損傷樣本免疫細胞浸潤的差異,p<0.05表示差異有統計學意義。由圖3(b)可知,與對照組相比,AD患者皮膚損傷樣本的初始CD4+T細胞、活化記憶CD4+T細胞、濾泡輔助性T細胞、巨噬細胞M1、靜息樹突狀細胞、活化樹突狀細胞浸潤水平顯著上升,記憶B細胞、活化自然殺傷細胞、巨噬細胞M2、活化肥大細胞則顯著下降。

圖3 樣本中21種免疫細胞分析結果Fig.3 Analysis results of 21 immune cell in the sample

由圖3(c)可知,漿細胞與記憶B細胞呈較強正相關(r=0.61),靜息樹突狀細胞與靜息肥大細胞呈較強負相關(r=-0.69),靜息樹突狀細胞與巨噬細胞M2呈較強負相關(r=-0.66)。

為了探索生物標志物與免疫細胞的關聯性,進行了相關性分析,結果如圖4所示。MMP12與樹突狀細胞、活化記憶CD4+T細胞、濾泡輔助性T細胞、巨噬細胞M1、初始CD4+T細胞、初始B細胞呈較強正相關;與CD8+T細胞、記憶B細胞、巨噬細胞M2、活化自然殺傷細胞、靜息肥大細胞呈較強負相關。WIF1則與之相反。

圖4 生物標志物與免疫細胞的關聯性分析結果Fig.4 Results of correlation analysis between biomarkers and immune cells

3 討 論

在訓練集中篩選出了159個差異表達基因,其中上調基因54個,下調基因105個。隨后利用LASSO、SVM-RFE、RF算法對差異表達基因進一步篩選,最終得到2個交集基因:MMP12和WIF1。

通過免疫浸潤分析,我們發現正常對照皮膚樣本和AD患者皮膚損傷樣本之間免疫細胞組成存在顯著差異。靜息肥大細胞在對照組中是主要的免疫細胞,而在AD組占比明顯下降。因此我們推測靜息肥大細胞可能在維持皮膚穩態中起重要作用。在一項小鼠試驗中,研究人員發現肥大細胞缺陷小鼠表現出皮膚炎癥減輕,這表明過敏原誘導的皮膚炎癥需要肥大細胞活化[15]。在AD患者皮膚損傷組織中靜息/活化樹突狀細胞在AD組的占比顯著上升,樹突狀細胞是抗原呈遞細胞的一種,可捕獲抗原、過敏原和微生物,將初始T細胞啟動為免疫原性或耐受原性亞群,并充當先天免疫和適應性免疫之間的橋梁。有研究表明樹突狀細胞直接參與AD特異性免疫過程,導致可溶性介質的釋放和T細胞的激活,從而致使疾病惡化[16]。在我們的分析中,巨噬細胞M1顯著增加、M2則顯著減少。眾所周知,M1巨噬細胞本質上是促炎細胞,其主要功能是通過吞噬作用或殺菌活性殺死或清除外來抗原或病原體。M2巨噬細胞具有愈合功能,在組織修復和維持組織完整性方面具有重要作用[17]。在一項皮膚活檢研究中也證實了巨噬細胞M1在特應性皮炎表現出顯著特異性[18]。我們還發現活化自然殺傷細胞在AD患者皮膚損傷樣本中的占比顯著減少。而一項研究發現小鼠自然殺傷細胞缺乏與皮膚中Th2炎癥的增強有關,表明自然殺傷細胞在AD的病理學中起著關鍵的免疫調節作用[19]。此外,CD4+T細胞、濾泡輔助性T細胞、記憶B細胞也被證明在AD的發生發展中發揮重要作用[20-21]。

MMP12是一種由肺泡巨噬細胞產生的彈性蛋白酶,誘導各種炎癥細胞聚集成炎性組織,與許多慢性炎癥性疾病有關,包括哮喘和動脈肝硬化[22]。MMP12的表達異常與AD患者的全身特應性存在相關性[23]。有研究報告了AD患者MMP12在炎癥部位顯著增加,通過度普利尤單抗治療后檢測到MMP12有所減少,這也說明MMP12在AD中具有特異性[24]。WIF1是WNT通路的一個抑制因子,它可以直接與WNT分子結合,抑制WNT子與受體細胞膜上的卷曲蛋白受體及低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6形成三聚體復合物,從而抑制信號傳導。WNT信號通路在細胞命運決定、發育過程中的組織模式及損傷后的組織修復中發揮著重要作用。WNT配體和信號在調節免疫反應中也具有重要意義。有證據表明,WNT信號通路既影響巨噬細胞功能又受巨噬細胞功能的影響[25]。在WNT配體存在的情況下,WIF1在角質形成細胞靜止和分化中具有潛在作用[26]。迄今為止,沒有直接證據證明WIF1在特應性皮炎中的作用,故需進一步調查以闡明潛在的生物學途徑。

4 結 論

本研究發現了2個與AD相關的生物標志物:MMP12、WIF1。MMP12、WIF1基因表達水平與AD患者皮膚損傷樣本的免疫細胞浸潤密切相關。因此,MMP12、WIF1有望成為特應性皮炎潛在的診斷生物標志物及免疫相關治療靶點。