不同敏感培養基對鼠疫菌生長作用的效果評價

馮建萍,王 梅,李存香,張愛萍,趙海紅,金 星,李廣輝

(青海省地方病預防控制所,青海 西寧 810021)

鼠疫是自然疫源性疾病,具有傳播快、病死率高的特點。青海省有兩處鼠疫自然疫源地,即喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地和青海田鼠鼠疫自然疫源地[1],其主要宿主為細菌學判定的偶蹄類染疫動物喜馬拉雅旱獺、藏系綿羊等[2]。關于鼠疫宿主的判定、新疫源地的發現、鼠疫疫源性的分析研究,都需要通過鼠疫病原菌的分離鑒定才能做出正確診斷[3]。因此,作為鼠疫菌生長“溫床”的培養基就顯得尤為重要,在鼠疫細菌檢驗中發揮著重要作用。鼠疫菌雖然在普通培養基上能夠生長發育,但只有在一般含有鼠疫菌的新鮮材料上才能獲得滿意的結果。為使鼠疫菌能良好發育,實驗室目前以添加脫纖維兔溶血為主要培養基[4]。本試驗以喜馬拉雅旱獺血液、綿羊血液、布氏菌專用血培養、脫纖維兔溶血為刺激劑制成敏感培養基,評價其用于鼠疫菌的生長效果,為今后鼠疫敏感培養基篩選、鼠疫現場應用和鼠疫病原學研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1材料 鼠疫(EV76-Paris)株,由國家鼠疫菌專業實驗保藏中心提供;脫纖維藏系綿羊血液,購自源葉生物公司;喜馬拉雅旱獺全血,采集自青海省海南藏族自治州同德縣河北鄉;脫纖維兔溶血,由青海省地方病預防控制所培養基室提供;布氏菌專用血,購自青島中創匯科生物科技有限公司;磷酸氫二鈉,購自天津市凱通化學試劑有限公司;氯化鈉,購自天津市登科化學試劑有限公司;進口蛋白胨、瓊脂粉購自北京欣經科生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1培養基基礎液制備 稱取去筋膜、無脂肪碎牛肉1 000 g,放入1 500 mL水中,煮沸30 min,待冷卻至56℃時加入無水碳酸鈉15 g、胰蛋白酶5 g,用1 mol/L氫氧化鈉矯正PH為7.8,加入三氯甲烷15 mL,置37℃振蕩溫箱7～9 d[5,6]。

1.2.2基礎液氨基氮含量測定 用1 mol/L氫氧化鈉滴定1.4 mg的公式計算,結果乘以100即為100 mL培養基內所含氨基氮的毫克數[7]。

1.2.3培養基添加劑選擇 選取4種不同添加劑,即兔溶血液、綿羊血液、喜馬拉雅旱獺血液和布氏菌專用血培養,將其添加到普通培養基中制成赫氏敏感培養基[8]。

1.2.4培養基制備 按常規法制成基礎培養基[8]。共制作5 000 mL,其中1 000 mL普通培基作為對照組,其余4 000 mL,每1 000 mL分別加入兔溶血液、綿羊血液、喜馬拉雅旱獺血液和布氏菌專用血各10 mL,混勻傾注平皿,放入37℃溫箱24 h無菌生長后方可使用[9]。

1.2.5活菌數測定 取EV7628℃ 24 h培養物,按常規稀釋方法進行稀釋,使鼠疫菌懸液最終濃度為1 000個菌/mL,分別接種鼠疫菌懸液0.1 mL放置于制備好的5種培養基平皿中,并用L棒涂抹均勻,28℃培養48 h后計算菌落數[10]。

2 結果

2.1不同敏感培養基對鼠疫菌生長的影響 為進一步明確5種培養基對鼠疫菌的不同刺激作用,經計算得出秩和平均值分別為56.90、74.91、128.82、64.91、111.11,其中3組和5組培養基的秩和平均值明顯大于其他三組培養基,說明,綿羊血液和喜馬拉雅旱獺血液培養基對鼠疫菌的生長所起的作用優于普通赫氏培養基、兔溶血液培養基和布氏菌專用血制作的培養基(見表1)。

表1 不同敏感培養基對鼠疫菌生長的作用

2.2不同敏感培養基鼠疫菌生長情況的統計學分析

幾種敏感培養基對鼠疫菌的生長情況經統計學分析,差異有明顯的統計學意義(F=53.681,P=0.000,P<0.05)。由此說明,綿羊血液培養基和喜馬拉雅旱獺血液培養基對鼠疫菌的生長作用優于其他三組培養基,即對鼠疫菌生長有明顯的促進作用,是比較理想的添加劑(見表2)。

表2 不同敏感培養基對鼠疫菌生長情況的統計學分析

3 討論

鼠疫是典型的自然疫源性疾病,從生態學角度來看,鼠疫菌、宿主和媒介之間具有特殊的寄生鏈關系,既互相依存,又相互制約。鼠疫病原體的宿主是維持鼠疫自然疫源地的穩定因素和基本條件[11],分離到鼠疫菌是鼠疫判定的依據之一,它的生長發育需要多種營養和生長調節物質,當其缺乏時,生長發育將受阻。鼠疫菌在繁殖過程中,其生長發育所需的營養和生長因子主要依靠培養基供給[12]。培養基是鼠疫菌生長的溫床,是鼠疫菌分離營養的基礎介質,也是檢驗的重要環節之一[13]。若從含菌量稀少的材料,特別是腐敗材料中單獨依靠普通瓊脂培養基是非常困難的,必須采用優質培養基[14]。為使鼠疫菌更好地生長和繁殖,在基礎培養基制備過程中通常加入刺激鼠疫菌生長的因子[15]。有學者研究認為,血液是鼠疫菌生長的最好刺激劑,它的原理在于降低培養基內的氧壓,利于鼠疫菌的發育。血液中的血紅素還能刺激鼠疫菌的呼吸,縮短其遲致期限[16]。實驗室一般習慣用家兔溶血,且以脫纖維兔溶血更佳。其它血液對鼠疫菌的生長作用效果如何,目前尚無報道。本研究將用綿羊血液、喜馬拉雅旱獺血液、兔溶血液和布氏菌專用血分別添加到普通培養基中制成敏感培養基,通過活菌計數觀察鼠疫菌的生長情況。經統計學秩和檢驗分析,P<0.05的差異有統計學意義。由此說明,綿羊血液培養基和喜馬拉雅旱獺血液培養基對鼠疫菌的生長作用優于兔溶血培養基、布氏菌專用血培養基和普通赫氏培養基,是比較理想的添加劑。通常情況下,鼠疫菌敏感培養基常采用脫纖維兔溶血,但綿羊血液和喜馬拉雅旱獺血液對鼠疫菌的生長刺激作用如何,之前從未進行過試驗。本研究通過活菌計數統計學分析發現,綿羊血液和喜馬拉雅旱獺血液也是比較理想的鼠疫敏感培養基添加劑。

喜馬拉雅旱獺是松鼠科嚙齒類動物,是一種比較兇猛的野生動物,具有一定的攻擊性,捕獲難度很大,造成實驗動物數量不足且采血困難。盡管旱獺血液對鼠疫菌的生長具有良好的作用,但在日常實驗室培養基制備時不適用。藏系綿羊隸屬偶蹄?？票P羊屬動物,廣泛分布于青藏高原鼠疫自然疫源地內,宜采血,對腐敗及含菌量稀少的材料適用性較佳。家兔作為實驗動物模型在實驗室普遍使用,它的血液作為敏感培養基的刺激劑適用性很強。因此,脫纖維綿羊血和兔溶血均可以作為鼠疫菌生長的理想刺激劑[17]。