昆蟲桿狀病毒及其應用研究進展

梁振普,陳陽光,杜俊陽,曹瀚文,張小霞,代金平,楊新平,蘇萍

(1.河南農業大學生命科學學院,河南 鄭州 450002;2.新疆農業科學院微生物應用研究所,新疆 烏魯木齊 830091;3.新疆生產建設兵團第十四師農業科學研究所, 新疆 昆玉 848116)

眾所周知,害蟲對農作物的破壞會造成巨大的經濟損失[1]。在害蟲的應急防控中,化學殺蟲劑的使用仍然是傳統的技術手段。由于化學殺蟲劑的廣泛使用,不僅造成了環境污染,同時隨著同類殺蟲劑的反復使用,不可避免地造成了目標害蟲抗藥性增加等諸多生態學問題[2-3]。相對于化學防治,生物防治是一種對環境友好的防治策略。生物殺蟲劑(如桿狀病毒殺蟲劑)因其具有特異性高、易于生物降解、對哺乳動物和環境都安全等諸多優點,在現代農業綠色防控中也逐漸受到重視[4-5]。但是野生型桿狀病毒殺蟲劑具殺蟲譜窄、殺蟲速度較慢等缺陷,這在很大程度上妨礙了其推廣應用。針對野生型桿狀病毒在應用中的不足之處,人們通過基因工程技術對其進行分子改良,有望改進這些缺點,從而增加這類殺蟲劑的市場競爭力。

本文綜述了桿狀病毒和其作為殺蟲劑方面的應用、桿狀病毒殺蟲劑的生產工藝及在遺傳改良方面取得的進展,同時對昆蟲桿狀病毒殺蟲劑的應用前景進行了展望。

1 桿狀病毒的概述

桿狀病毒屬于桿狀病毒科(Baculoviridae),其特點是有包涵體(occlusion body,OB),鑒于其OB的形態特征可分為兩個屬,即核型多角體病毒屬(Nucleopolyhedrovirus,NPV)和顆粒體病毒屬(Ganulovirus,GV),其中NPV的包涵體呈現不規則多角體形狀,GV的包涵體呈圓形或卵圓形[6]。桿狀病毒是一類對節肢動物具有感染性的病毒,具有很高的宿主特異性。桿狀病毒在其生命周期中會產生兩種形式的病毒粒子,即包埋型病毒粒子(occlusion-derived virion,ODV)和芽生型病毒粒子(budded virion,BV)[6]。這兩種病毒粒子的核衣殼結構相同,但囊膜來源不同,BV的囊膜來源于細胞膜,而ODV的囊膜來源于核膜,這導致了兩種病毒粒子在侵染過程中發揮不同的作用。其中,BV負責在細胞間進行傳播,而ODV在經口感染宿主的過程中發揮著重要作用[7]。包涵體是ODV被多角體蛋白包裹形成的穩定結構,可以幫助桿狀病毒抵抗外界環境的降解,在桿狀病毒的應用方面具有不可替代的作用。

2 昆蟲桿狀病毒載體表達系統及其應用

昆蟲桿狀病毒表達系統 (baculovirus expression vector system,BEVS) 是一種在昆蟲細胞內進行蛋白表達的表達系統,現已廣泛應用于外源蛋白表達、病毒樣顆粒表制備、桿狀病毒表面展示系統等領域。在當今基因工程領域四大表達系統中,由于BEVS可以同時表達多個蛋白并且可以對蛋白進行翻譯后修飾,使其成為應用廣泛的真核表達系統[8]。

利用桿狀病毒表達外源蛋白,需要制備具有感染性的重組病毒,而最初構建重組桿狀病毒是用同源重組的方法,此方法制備重組桿狀病毒需要經過多輪空斑篩選,其過程費時費力,同時,也極易得到假陽性重組病毒。為了解決以上問題,LUCKOW等[9]將細菌的mini-F復制子整合到桿狀病毒基因組,構建一種既能在大腸桿菌中復制,也能感染昆蟲細胞的新型桿狀病毒穿梭載體(bacmid)。圖1是重組桿狀病毒構建示意圖。具體過程如下:首先,將目標基因插入到供體(donor)質粒,獲得重組donor質粒。然后,將重組donor質粒轉化到大腸桿菌DH10Bac細胞,在輔助(helper)質粒編碼的轉座酶幫助下,將位于重組donor質粒Tn7R-Tn7L間的外源基因特異性地轉座到bacmid上,通過藍白斑篩選和PCR鑒定可獲得重組bacmid。

圖1 重組桿狀病毒構建示意圖Figure 1 Schematic diagram of recombinant baculovirus construction

2.1 外源蛋白表達

通過對桿狀病毒表達系統的不斷優化,使得外源基因插入到桿狀病毒表達載體中的成功率有所提高,所以有越來越多的外源基因可以通過該系統進行表達。該系統進行外源蛋白表達有以下優點:1)可以對外源蛋白進行翻譯后修飾;2)BEVS具有強啟動子,如強多角體蛋白啟動子或P10強啟動子,可以高水平表達外源蛋白;3)可以同時表達多個外源蛋白。該系統表達的外源蛋白有以下應用:1)BEVS產生的蛋白質可用藥物篩選、外源蛋白結構和功能分析、生產蛋白質治療藥物[10-11];2)表達多種蛋白質,包括糖蛋白、酶、重組病毒、酶和疫苗。

2.2 昆蟲桿狀病毒表達病毒樣顆粒

病毒樣顆粒(virus-like particle, VLP)是由一個或多個內源結構蛋白組裝形成的結構化蛋白顆粒,缺乏病毒遺傳物質,因此不具有傳染性[12];根據親本病毒的結構,VLP存在有無包膜之分。構建的VLP在形態結構上與天然的病毒顆粒相似,因此可以高效地誘發體液與細胞免疫,具有很強的生物學活性,這被認為是一種安全的候選疫苗[13-14],是一種可以展示真實構象的病毒抗原。

目前,VLP的生產常利用昆蟲桿狀病毒表達系統[15]。人乳頭瘤病毒、流感病毒[16]、丙型肝炎病毒、脊髓灰質炎病毒等病毒都在昆蟲桿狀病毒系統中成功表達出了病毒樣顆粒[17]。VLP還可借助先進的材料進一步得到廣泛應用。目前,VLP被用作納米機器[18],將藥物活性產品輸送到人體內的特定細胞的特定部位。在全球流行的COVID-19方面,VLP生產的COVID-19疫苗同樣具有優勢,可以通過BEVS合成新冠病毒蛋白,形成VLP[11]。

2.3 桿狀病毒表面展示系統及其應用

桿狀病毒展示技術(baculovirus surface display,BSD)是一種在桿狀病毒表面展示外源性多肽和蛋白質的新方法。它是創建和展示表位特異性抗體結合位或任何其他感興趣的肽或蛋白質的有效方法,可用于抗體、疫苗和生物藥物的研發[19-20]。在桿狀病毒上展示感興趣的蛋白質,通常是在衣殼或病毒囊膜上進行展示[21]。一種展示策略是在AcMNPV上進行了外源蛋白的插入,在主要的囊膜蛋白GP64上進行了融合或者將外源蛋白融合到GP64的氨基末端[22-23]。另一種展示策略是與桿狀病毒的衣殼蛋白融合,例如AcMNPV最豐富的核衣殼蛋白VP39。在VP39的氨基或羧基末端融合導致成功展示感興趣的蛋白質[19]。

3 昆蟲桿狀病毒在殺蟲劑中的研究及應用

3.1 昆蟲桿狀病毒殺蟲劑的優缺點

昆蟲病原病毒是微生物源殺蟲劑的重要種類,大多數研究集中在桿狀病毒上。桿狀病毒作為殺蟲劑有以下幾個優點:1)在眾多昆蟲病毒中,桿狀病毒被認為是安全且有選擇性的生物殺蟲劑,僅限于無脊椎動物,它們在世界范圍內被廣泛用于防治以鱗翅目為主的多種害蟲[24],也對非目標生物無害,包括有益的捕食者、脊椎動物和植物[25-26];2)桿狀病毒可在昆蟲種群中引起流行,并在環境中長期有效[27];3)昆蟲對許多化學農藥產生抗性,但桿狀病毒殺蟲劑對昆蟲的使用很少產生抗性[24];4)桿狀病毒可以與其他害蟲防治方法一起使用,提高殺蟲效率。

缺點:1)由于桿狀病毒具有較高的特異性,使其宿主范圍變窄,限制了應用范圍[28];2)殺死目標害蟲的速度相對較慢,某些桿狀病毒,如核型多角體病毒,通常需要3～7 d時間才能殺死宿主[29];3)昆蟲病毒不易長期儲存,生產成本相對于傳統化學農藥高[29-30]。

3.2 昆蟲桿狀病毒殺蟲劑的應用

3.2.1 獨立使用 桿狀病毒殺蟲劑在許多國家被用于鱗翅目、膜翅目和鞘翅目的防治,其中在控制鱗翅目害蟲中應用最為廣泛[31-32]。目前,世界各地已經開發了使用昆蟲桿狀病毒殺蟲劑的項目,許多桿狀病毒殺蟲劑已經在阿根廷、澳大利亞、加拿大、哥倫比亞、德國、印度、日本、秘魯、南非和美國等國家注冊[29,33-36]。中國昆蟲病毒的研究始于20世紀50年代中期家蠶核型多角體病毒,而將昆蟲病毒作為生物防治劑的使用始于20世紀60年代初[37]。迄今為止,中國已使用超過32種昆蟲病毒來控制農業、林業、牧場和花園中的害蟲。截至2023年,12種病毒被中華人民共和國農業農村部批準為商品病毒殺蟲劑,其中10種屬于桿狀病毒科(http://www.chinapesticide.org.cn/hysj/index.jhtml)。

3.2.2 復配使用 由于桿狀病毒單獨用于防治害蟲會導致以下兩個問題:一是殺蟲速度緩慢,導致農作物受損嚴重;二是病毒的宿主特異性強,導致只作用一種害蟲。在應用上,經常把桿狀病毒與其他成分進行復配使用,根據復合劑復合成分的不同,可把昆蟲病毒復合殺蟲劑概括為兩大類型:一種類型是低毒化學農藥與病毒復配的殺蟲劑,該殺蟲劑可顯著提高殺蟲效率,同時也減少了化學農藥的用量;第二種類型是微生物與病毒復合的殺蟲劑,該殺蟲劑具有廣譜性、速效性和特異性[38]。昆蟲病毒與微生物復合生物殺蟲劑既具有良好從殺蟲效果,又能克服重組病毒生產上的困難,易于實現產業化。例如,20世紀80年代美國亞利桑那大學西棉研究室采用AcNPV與Bt復配劑防治棉花煙芽夜蛾,近年來我國采用小菜蛾顆粒體病毒-Bt復合生物殺蟲劑防治小菜蛾都取得了令人十分滿意的防治效果[39]。

3.3 昆蟲桿狀病毒的遺傳改造

實踐表明,與化學殺蟲劑相比,桿狀病毒殺蟲劑具有高度專一性、不殺傷天敵、對哺乳動物和環境安全等優點[6]。但是,野生型昆蟲桿狀病毒具有殺蟲速度慢、穩定性差和宿主域窄等缺點,因此學者們開始利用基因工程和分子生物學等手段來改造昆蟲病毒基因組,以創制高效、穩定、防治面較廣的昆蟲桿狀病毒殺蟲劑[40-41]。

3.3.1 將外源基因插入桿狀病毒基因組 可以利用基因工程技術,將外源基因插入到桿狀病毒基因組中構建重組病毒,以提高殺蟲效率[42]。這些外源基因大致有2種類型:一類是昆蟲激素,它們參與調節宿主昆蟲發育、行為和生理狀態。在桿狀病毒感染期間,它們的過度表達會改變昆蟲宿主的發育、行為或穩態,進而導致幼蟲宿主更快地死于病毒感染或更快地停止進食[43]。目前普遍常用的昆蟲激素有利尿激素、羽化激素、促前胸腺激素和保幼激素酯酶[44-47]。另一類外源基因是來自各種有毒動物的神經毒素,包括草螨毒素tox34.4,蝎神經毒素AaIT和LqhIT2,蜘蛛毒素μ-Aga-Ⅳ、Cit1a和Ar1b,以及?？舅谹s Ⅱ和Sh Ⅰ,這些毒素可作用于害蟲引起害蟲麻痹,停止進食進而加速死亡[2]。重組桿狀病毒殺蟲效率因啟動子、外源基因、宿主昆蟲、病毒劑量和侵染方法的不同而產生不同的殺蟲效果[48]。

3.3.2 缺失桿狀病毒的非必需基因的殺蟲劑 由于桿狀病毒基因組中存在一些對病毒自身復制、增殖非必需的基因。因此,可缺失和修飾非必需基因,進而提高桿狀病毒的殺蟲效率[49]。目前,人們已經構建出缺失egt、p10和p74基因的重組桿狀病毒[47,50-51]。最成功的例子是egt的缺失能夠顯著增強桿狀病毒的致病性,進而提高殺蟲效率。egt編碼蛻皮甾體脲苷二磷酸葡糖轉移酶(ecdysteroid UDP-glucosyltransferase,EGT),是桿狀病毒非必需的早期基因, 同時也是昆蟲病毒中迄今為止已知的唯一在個體水平調控感染宿主的基因[52]。EGT酶通過催化糖分子與蛻皮甾體激素結合,阻止蛻皮甾體進入細胞并有效地滅活蛻皮甾體激素,從而阻止幼蟲蛻皮,進而導致幼蟲繼續取食、體重增加、病毒產量提高[47,52-53]。研究發現egt的缺失往往會加速宿主幼蟲的死亡,因此可以通過對egt的缺失來提高殺蟲效率[54]。

3.3.3 拓寬殺蟲譜的殺蟲劑 由于桿狀病毒通常具有較窄的殺蟲譜,了解它們控制宿主范圍的機制是改進其作為殺蟲劑應用的先決條件[28]。先前的研究報道了一些與宿主范圍相關的基因如p143、hrf-1、hcf-1、ie2、p35和iap,通過對這些基因的修飾或者缺失能夠使宿主的范圍變廣[55]。最近研究發現將缺乏p35的AcMNPV突變體(vAc Δp35)和SeMNPV的DNA片段共轉染Sf9細胞,得到宿主范圍擴大的重組病毒株(vAcRev)。在四種昆蟲細胞系和三種昆蟲幼蟲中驗證了 vAcRev的宿主特異,發現其不僅能夠感染該病毒的親本宿主,而且能夠感染其他昆蟲宿主[34]。

3.3.4 影響昆蟲激素相關基因的表達 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是通過內源或外源雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)引發mRNA降解,導致特異性基因沉默,在生物學研究中廣泛應用并顯示出巨大的潛力[56-57]。在防治農業害蟲和病原體方面,RNAi技術已成為研究基因功能的有力遺傳工具[58]。先前的研究發現,JH酸性甲基轉移酶(JHAMT)是一種不可替代的酶,在保幼激素(JH)合成中尤為重要。JH結合蛋白基因(JHBP)可以保護化學不穩定的JH免受非特異性酶降解,抑制兩個基因HaJHAMT和HaJHBP的表達,以降低棉鈴蟲的JH濃度并進一步影響幼蟲的存活[43,59-60]?；诖?LIU等[43]構建了針對棉鈴蟲JHAMT和JHBP dsRNA的重組HearNPV,通過抑制這兩個基因的表達進而提高桿狀病毒的殺蟲活性。

MicroRNAs(miRNAs)是一類小的非編碼RNA,能夠在轉錄后水平調控mRNA的表達具有重要的生物學功能[61-62]。在昆蟲中,miRNAs已經被證明可以調節整個生命周期的各種生理過程,包括蛻皮、變態、卵發生、胚胎發生、行為和免疫[62-63]。miRNA在桿狀病毒感染和病毒宿主相互作用中也起著重要作用[64]。研究發現bantam是Sf9細胞中最豐富的miRNA之一。用bantam的抑制劑飼喂斜紋夜蛾和甜菜夜蛾的幼蟲,可以導致昆蟲幼蟲生長異常、化蛹率降低、增加AcMNPV對昆蟲的傳染性、導致幼蟲加速死亡[65-66]。當抑制bantam的水平時,可以提高受感染昆蟲的蛻皮激素(20-羥基蛻皮激素)的水平,導致對桿狀病毒感染的易感性增加,使病毒具有更強的殺蟲活性和更短的致死時間[64]。

4 桿狀病毒殺蟲劑的生產

桿狀病毒和其他病毒一樣,只能在活細胞、活組織或有機體中生長繁殖。用細胞培養來大規模生產昆蟲病毒,由于生產成本和生產過程中的技術問題,還沒有大規模應用。目前為止,大多數商業化的桿狀病毒的生產,還需要在宿主昆蟲中進行。桿狀病毒殺蟲劑生產工藝一般分為工廠化生產和野外田間生產。

以棉鈴蟲桿狀病毒殺蟲劑為例,工廠化生產桿狀病毒殺蟲劑的步驟包括選留蟲種、成蟲交配產卵、幼蟲飼養、病毒感染增殖、病死蟲收集、制劑加工、產品檢測和分裝等。選擇健康的棉鈴蟲,在產卵箱內進行交配產卵,蟲卵落在產卵箱的紙帕上。將帶有蟲卵的紙帕進行消毒,然后轉移到有人工飼料的養蟲盤上,最后放在飼養室。當幼蟲發育到4齡,5%用來留種,95%用來生產病毒。感染后第6天開始收集病死幼蟲。將收集的病毒致死幼蟲,經研磨,離心除雜,噴霧或者冷凍干燥,再加輔助劑混合,經0.25 mm過篩,即成可濕性粉劑,檢驗合格后稱量分裝[67]。

以茶蠶顆粒體病毒殺蟲劑為例,野外田間生產桿狀病毒殺蟲劑的步驟如下:選擇存在大量茶蠶的茶園、于茶蠶2～3齡期噴灑病毒、接毒后7～15 d即為感病死亡高峰期、病死蟲收集、制劑加工、產品檢測和分裝[68]。后面步驟基本同工廠化生產病毒殺蟲劑一致。

5 昆蟲桿狀病毒殺蟲劑的安全性

桿狀病毒作為生物農藥具有若干優勢。它們是自然產生的病原體,對昆蟲和密切相關的節肢動物具有高度特異性。就對脊椎動物(如哺乳動物、鳥類、魚類、兩棲動物、爬行動物)的致病性而言,它們是安全的。此外,它們對自然抑制害蟲種群的有益生物的致病性是友好的[4-5]。雖然桿狀病毒在昆蟲種群的自然控制中起著重要作用,但從農業工業的角度來看,天然桿狀病毒是不完美的殺蟲劑。許多作物只能承受最低程度的果實或葉面損害。天然桿狀病毒的自然殺傷速度為3～7 d以上。利用重組DNA技術修飾桿狀病毒,解決了殺傷速度慢的問題,然而其安全性需要重新評估[69]。在研究重組病毒是否影響動物的試驗中,肖化忠等[70]將重組病毒口服或水中投毒感染健康的動物,并將感染后的動物解剖,組織切片及電鏡觀察。結果表明:被重組病毒感染的動物活動正常臟器無病變且電鏡觀察并沒有病毒粒子存在。在研究重組病毒是否影響培養細胞的試驗中,肖化忠等[70]將不同種類的細胞培養成單層,并使用不同梯度的BV去感染,最后不同時間點進行觀察,被重組病毒感染的細胞與對照組無明顯差別。盡管以上結果說明,重組病毒對動物是安全的對人和動物細胞不造成感染,但是重組病毒也不是絕對安全的,對其生物安全性還要進行長期、深入全面地分析和研究。

6 昆蟲桿狀病毒研究與應用展望

隨著對桿狀病毒的研究越來越深入,對桿狀病毒的應用也將越來越普遍。各種各樣的病毒和疾病等危害人類和其他哺乳動物的生存,桿狀病毒表達系統在疫苗研究、基因治療、藥物篩選、蛋白表達方面和生物殺蟲劑方面越來越重要。近3年來,在全球范圍爆發的新冠肺炎病毒,桿狀病毒表達系統被用來表達新冠病毒蛋白形成VLP,這進一步揭示了在未來醫療方面,桿狀病毒表達系統將被應用更加廣泛。在未來的基因治療領域,桿狀病毒可能針對某些癌癥、遺傳病、基因缺陷等疾病有不可低估的應用前景。針對農業害蟲防治,重組昆蟲桿狀病毒殺蟲劑的研究可從以下幾個方面考慮:一是尋找一些新的外源基因,充分利用基因工程技術對桿狀病毒進行改造,提高殺蟲效率;二是解決重組昆蟲桿狀病毒殺蟲劑在生產中遇到的問題,降低生產成本;三是解決重組昆蟲桿狀病毒殺蟲劑在運輸和保存中遇到的問題,保證高質量重組昆蟲桿狀病毒殺蟲劑的供應;四是探索桿狀病毒在大田環境中應用的穩定性,從而為以后昆蟲桿狀病毒殺蟲劑的進一步開發和應用打下基礎。