尿素和麥麩對糙皮側耳生長發育和子實體營養組成的影響

張鵬濤,竹瑋,2,胡延如,戚元成,申進文,文晴,王風芹

(1.河南農業大學生命科學學院,河南 鄭州 450046; 2.信陽市農業科學院,河南 信陽 464000)

氮是生物體生長發育重要的必需營養元素之一[1]。氮含量對食用菌菌絲生長、原基分化和子實體形成具有重要影響,不同食用菌對培養料中氮含量要求不同。廣葉繡球菌在培養料碳氮比值為39.2∶1～80.8∶1時,菌絲生長速率無顯著差異,在碳氮比值為48.8∶1～55.9∶1時,生物學效率最高[2];秀珍菇在培養料碳氮比值為67∶1～69∶1時,菌絲生長最好,在碳氮比值為69∶1時,生物學效率最高[3];猴頭菇在培養料碳氮比值為38∶1時,生長最快,長勢最好,子實體生物學效率最高[4];斑玉蕈在培養料碳氮比值為33∶1時,生物學效率最高[5]。杏鮑菇菌絲生長速率與培養料的碳氮比值呈負相關[6],而灰樹花、金針菇、姬松茸的菌絲生長速率都與培養料碳氮比值呈正相關[7-9]。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

糙皮側耳(Pleurotusostreatus)新831菌株由河南農業大學應用真菌研究室保存并提供。

1.2 供試原料

棉籽殼(碳質量分數39.81%、氮質量分數1.45%、碳氮比值為27.5∶1)購自虞城縣潤達棉業有限公司;麥麩(碳質量分數40.80%、氮質量分數3.25%、碳氮比值為12.6∶1)購自許昌盛沃糧油有限公司;尿素(分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司;石灰和輕質碳酸鈣均購自三門峽市三山石膏粉廠。

1.3 栽培試驗

培養料配方來自河南農業大學應用真菌研究室,以棉籽殼作為主料,尿素和麥麩作為氮源,共16種(配方1-1～1-8,配方2-1～2-8),其中以不加尿素(配方1-1)和不加麥麩(配方2-1)為對照組,具體見表1。根據配方準確稱取栽培原料并混合攪拌均勻,然后加水攪拌,調整培養料含水質量分數65%。培養料拌勻后裝入22 cm×36 cm×0.004 cm的聚乙烯折角袋,用塑料套環封口,每袋裝濕料1.75 kg,100 ℃常壓滅菌16 h。當料袋溫度降至30 ℃以下時,無菌接入糙皮側耳固體菌種,保證接種量一致(200 g),套環封口。料袋接種后搬入同一培養室發菌。保持發菌環境清潔衛生,控制環境溫度22 ℃,在氧氣充足、黑暗且干燥條件下培養。觀察糙皮側耳菌絲長勢,測定菌絲生長長度,計算菌絲生長速率。每個配方200袋,設置3次重復。

表1 培養料配方Table 1 Culture substrates formulas g·kg-1

菌絲滿袋后搬入出菇車間出菇。子實體生長期間,控制溫度15 ℃、空氣相對濕度90%及二氧化碳體積分數在0.1%以下,給予100 lx散射光使糙皮側耳子實體正常生長。糙皮側耳子實體八分成熟(即菌蓋邊緣基本平展)時及時采收。記錄出菇時間、子實體質量等指標。每潮菇采收后,停水養菌7 d,然后按照上述方法重復進行出菇管理。對三潮菇進行采收。

1.4 培養料碳、氮質量分數測定

每個處理隨機選取3個滅菌后的栽培袋,將培養料揉碎混勻,然后稱取200 g于65 ℃烘干至恒質量。參考申進文等[13]所述方法測定培養料中碳、氮質量分數。

1.5 糙皮側耳菌絲生長和生物學效率測定

糙皮側耳菌絲長勢、菌絲生長速率和一、二、三潮菇子實體生物學效率及子實體總生物學效率的測定和計算參考申進文等[13]所述方法。

1.6 子實體營養成分測定

取不同處理的第一潮子實體500 g,烘干至恒質量。參考申進文等[13]所述方法測定子實體蛋白質、總糖、粗脂肪和粗纖維質量分數等指標,每個處理5次重復。

1.7 培養料中含量測定

1.8 培養料中基質降解酶活性測定

1.8.1 粗酶液制備 按照1.7的方法取發菌培養料5.0 g于25 mL磷酸緩沖鹽(phosphate buffered saline,PBS)溶液中,220 r·min-1、4 ℃水浴搖床低溫提取4 h后在8 000×g、4 ℃條件下離心10 min,取上清液即得胞外酶粗酶液,-80 ℃保存備用。每次測定3袋,每袋取3個樣。

1.8.2 漆酶活力測定 參考郭艷艷等[15]所述方法測定粗酶液中的漆酶活性。漆酶酶活力單位(U)定義:1 min內催化2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)生成1 mmol ABTS自由基的酶量為1個酶活力單位。

1.8.3 羧甲基纖維素酶活力測定 參考孫淑靜等[16]所述方法測定粗酶液中羧基甲基纖維素酶的酶活。羧甲基纖維素酶活力單位(U)定義:在溫度50 ℃反應條件下,1 min催化生成1 mg葡萄糖所需的酶量為1個酶活力單位。

1.8.4 木聚糖酶活力測定 參考孫淑靜等[16]所述方法測定粗酶液中的木聚糖酶活力。木聚糖酶活力單位(U)定義:在50 ℃反應條件下,1 min時間催化生成1 mg木糖所需的酶量定義為1個酶活力單位。

1.8.5 蛋白酶活力測定 參考李治平等[17]所述方法測定粗酶液中的蛋白酶活力。蛋白酶活力單位(U)定義:在37 ℃反應條件下,10 min催化生成1 mg酪氨酸所需的酶量定義為1個酶活力單位。

1.9 數據分析

采用Excel軟件和SPSS 19.0統計軟件進行數據統計分析,結果以平均值±標準差表示。方差分析采用最小顯著性差異法,p<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同配方對培養料碳、氮質量分數及碳氮比值的影響

對各配方培養料的碳、氮質量分數進行了測定,計算出碳氮比值,結果見表2和表3。在研究設定的培養基配方范圍內,隨著尿素和麥麩添加量的增加,各處理培養料碳質量分數沒有顯著差異,而氮質量分數逐漸升高,碳氮比值逐漸降低。當尿素添加量為0～13 g·kg-1,此時氮質量分數為1.32%～1.74%,碳氮比值為21.7∶1～28.9∶1;當麥麩添加量為0～400 g·kg-1,此時培養料的氮質量分數為1.31%～2.01%,碳氮比值為19.4∶1～28.9∶1。

表2 尿素添加量對培養料的碳、氮質量分數及碳氮比值的影響Table 2 Effects of urea contents on the carbon and nitrogen mass concentration and C/N ratio in culture substrates

表3 麥麩添加量對培養料的碳、氮質量分數及碳氮比值的影響Table 3 Effects of wheat bran contents on the carbonand nitrogen mass concentration and C/N ratio in culture substrates

2.2 尿素和麥麩添加量對糙皮側耳菌絲生長和子實體生物學效率的影響

在設定培養基配方范圍內,隨著尿素和麥麩添加量增加,糙皮側耳菌絲長勢更加旺盛,菌絲潔白、濃密、粗壯,但是菌絲生長速率逐漸降低,滿袋時間逐漸延長。與對照組相比,添加13 g·kg-1尿素或400 g·kg-1麥麩試驗組的菌絲生長速率分別降低42.3%和27.1%(圖1)。糙皮側耳一、二、三潮子實體生物學效率均隨培養料中尿素和麥麩添加量的增加呈先升高后降低的趨勢。其中,第一潮子實體生物學效率為48.0%～61.8%。當添加5 g·kg-1尿素或300 g·kg-1麥麩時,糙皮側耳子實體總生物學效率最高,分別為118.1%和122.9%,較對照組分別提高26.2%和31.3%(圖2),此時培養料的氮質量分數分別為1.52%和1.86%,碳氮比值分別為25.0%和20.8%(表2和表3)。當尿素添加量高于9 g·kg-1時,各試驗組第三潮均未出菇,子實體總生物學效率較對照組顯著降低。其中,尿素添加量為13 g·kg-1處理組的子實體總生物學效率僅為對照的44.9%,而在設定培養基配方范圍內添加麥麩均能夠提高子實體總生物學效率。后續對子實體總生物學效率最高的處理組即尿素添加量5g·kg-1和麩皮添加量300 g·kg-1進行重點對比研究。

A:尿素;B:麥麩。++++:菌絲長勢最強;+++:菌絲長勢較強;++:菌絲長勢一般;+:菌絲長勢較弱。不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。A: Urea; B: Wheat bran. ++++: Luxuriant; +++: Strong; ++: Fair; +: Weak. Different lowercase letters indicate significant difference at p<0.05. The same as below.

圖2 培養料中尿素和麥麩添加量對糙皮側耳子實體生物學效率的影響Fig.2 Effects of urea and wheat bran content in culture substrates on fruiting body biological efficiency of Pleurotus ostreatus

2.3 尿素和麥麩添加量對糙皮側耳子實體營養成分的影響

在設定培養基配方范圍內,考察尿素和麥麩對糙皮側耳子實體營養成分的影響。隨著尿素和麥麩添加量的升高,糙皮側耳子實體的總氨基酸和粗蛋白質量分數呈上升趨勢,總糖質量分數呈下降趨勢,脂肪和粗纖維質量分數變化不顯著(表4和表5)。與對照組相比,添加5 g·kg-1尿素(即生物學效率最高組)的總氨基酸和粗蛋白質量分數分別較對照提高17.7%和11.9%,總糖質量分數變化不顯著。添加300 g·kg-1麥麩(即生物學效率最高組)的總氨基酸和粗蛋白質量分數分別較對照提高39.8%和34.6%,而總糖質量分數降低23.2%。添加300 g·kg-1麥麩與添加5 g·kg-1尿素相比,子實體總氨基酸和粗蛋白質量分數分別提高25.6%和29.4%,總糖質量分數降低20.0%。

表4 培養料中尿素添加量對糙皮側耳子實體營養成分的影響Table 4 Effect of urea content in culture substrates on nutrient composition (mass concentration) of Pleurotus ostreatus fruiting body %

表5 培養料中麥麩添加量對糙皮側耳子實體營養成分的影響Table 5 Effect of wheat bran content in culture substrates on nutrient composition (mass concentration) ofPleurotus ostreatus fruiting body %

2.4 尿素和麥麩添加量對培養料含量影響

表6 不同尿素添加量對糙皮側耳栽培過程中培養料含量的影響Table 6 Effect of different urea content on the content of culture substrates during growth and development of Pleurotus ostreatus mmol·kg-1

2.5 尿素和麥麩添加量對糙皮側耳基質降解酶活力的影響

比較糙皮側耳栽培過程中對照組、5 g·kg-1尿素試驗組和300 g·kg-1麥麩試驗組的基質降解酶活力變化,結果見圖3。添加5 g·kg-1尿素或300 g·kg-1麥麩試驗組的漆酶(圖3-A)、木聚糖酶(圖3-B)和纖維素酶(圖3-C)活力整體上均顯著高于對照組;在一潮采收之前的各時期,尿素或麥麩添加組的蛋白酶活力均顯著低于對照組。另外,添加2種氮源對基質降解酶活力的影響也存在差異,尿素添加組的漆酶活力在滿袋期和原基期均顯著低于麥麩添加組,而在一潮采收后的各時期均顯著高于麥麩添加組;尿素添加組蛋白酶活力在一潮采收后4 d之前均低于麥麩添加組,但在二潮采收期顯著高于麥麩添加組(圖3-D)。綜上可知,適當的尿素或麥麩添加可提高糙皮側耳木質纖維素降解酶活力,促進培養料的分解轉化。

A:漆酶;B:木聚糖酶;C:纖維素酶;D:蛋白酶。1:半袋期;2:滿袋期;3:原基期;4:一潮采收期;5:一潮采收后4 d;6:二潮采收期;7:二潮采收后4 d。A: Laccase; B: Xylanase; C: Cellulase; D: Protease.1: Half-bag stage; 2: Full-bag stage; 3: Primordial formation stage; 4: First harvesting stage; 5: 4 days after first harvesting stage; 6: Second harvesting stage; 7: 4 days after second harvesting stage.

3 結論與討論

本研究以尿素和麥麩為氮源,對比了棉籽殼熟料栽培糙皮側耳過程中不同氮源種類、碳氮質量分數和碳氮比值對糙皮側耳菌絲生長、子實體產量與營養成分的影響。結果發現,無論以尿素還是以麥麩為氮源,隨著氮源添加量增加,培養料氮質量分數升高、碳氮比值降低,糙皮側耳菌絲長勢逐漸變好,但菌絲生長速率逐漸降低。該結果與灰樹花、金針菇和姬松茸等[7-9]食用菌的研究結果一致,且與植物根系在低氮脅迫下伸長的生理現象相符[18]。李邦等[18]研究了高粱根系在低氮脅迫下根伸長的生理機制,發現低氮脅迫處理使高粱根系內源色氨酸含量顯著增加,依賴色氨酸途徑合成的生長素及協同提高的能量代謝促進了低氮下高粱根系的伸長。糙皮側耳在低氮培養料中菌絲生長速率比高氮培養料中更快的生理機制與植物根系響應低氮脅迫的機制是否相同還有待進一步探究。

另外,本研究發現以麥麩作為氮源時,糙皮側耳子實體生物學效率最高的培養料氮質量分數和碳氮比值分別為1.86%和20.8∶1,與麥麩和玉米芯熟料栽培糙皮側耳子實體生物學效率最高時培養料的氮質量分數和碳氮比值基本一致[10]。由此說明,同種氮源對不同主料栽培的糙皮側耳最適氮質量分數和碳氮比值無顯著影響。以尿素為氮源時,糙皮側耳生物學效率最高的培養料氮質量分數和碳氮比值分別為1.52%和為25.0∶1,與以麥麩作為氮源時存在顯著差異,表明2種不同氮源對糙皮側耳栽培的影響不同,推測主要是2種氮源的利用方式不同。添加尿素或麥麩能夠提高糙皮側耳栽培料中漆酶、木聚糖酶和纖維素酶活力,且2種氮源在某些時期對上述酶活力的影響存在顯著差異。而添加尿素或麥麩可抑制糙皮側耳營養生長期的蛋白酶活力,推測是接種初期尿素或麥麩被快速分解釋放的氨態氮和氨基酸等優先氮源抑制了蛋白酶基因的表達。此外,本研究還發現,不同尿素和麥麩添加量對糙皮側耳生物學效率的影響規律也存在顯著差異,在添加設定培養基配方范圍內的麥麩均起到增產的作用,而尿素添加量過高則導致生物學效率顯著降低,推測是高含量尿素在糙皮側耳脲酶作用下分解釋放產生了大量的銨態氮[12],后者可引發胞內活性氧積累、膜脂過氧化及酶失活[19-20],從而對糙皮側耳產生氨毒性[21]。

綜上所述,添加適量尿素或麥麩均能顯著提高糙皮側耳子實體產量及子實體總氨基酸和粗蛋白質量分數,經濟效益也得到顯著提高,但糙皮側耳利用尿素和麥麩為氮源時的最適氮質量分數和碳氮比值不同。棉籽殼熟料栽培糙皮側耳培養料中以尿素為氮源時,尿素的最適添加量為5 g·kg-1,培養料的氮質量分數為1.52%,碳氮比值為25.0∶1;以麥麩為氮源時,麥麩的最適添加量為300 g·kg-1,培養料的氮質量分數為1.86%,碳氮比值為20.8∶1。不同形態氮源對糙皮側耳栽培產量和子實體營養成分影響存在顯著差異,綜合來看,糙皮側耳熟料栽培采用麥麩等有機氮源更為適宜。