桃PpILR1基因調控分枝角度的功能解析

張杰, 沈芮先, 裴彎, 謝賀芳, 王小貝, 鄭先波, 連曉東,張海朋, 譚彬, 馮建燦

(1.河南農業大學園藝學院,河南 鄭州 450046; 2.河南省桃種質資源創新及利用工程技術研究中心,河南 鄭州 450046)

桃(PrunuspersicaL.)原產于中國,種質資源豐富,是世界上重要的栽培果樹之一。由分枝角度、節間長度、分枝數量等的差異形成了不同的樹型,桃樹型主要分為普通型、柱型、垂枝型、直立型、矮化型、半矮化型和曲枝型等[1-2]。目前,桃生產中的主栽品種為普通型,其分枝角度大、分枝數量多等特點不僅增加了勞動力成本的投入,還嚴重影響果實產量和品質。因此,優化樹體結構,培育適宜于省力化栽培的優良桃品種是解決桃產業發展瓶頸問題的關鍵。柱型桃是一類特異的桃種質,與普通型桃相比,其具有分枝角度小、二級分枝數量少等特點[3];分枝角度是影響果樹樹型的重要因素之一。植物分枝角度的形成受遺傳因素、環境因素和植物激素等的共同調控[4-5]。生長素是調控植物頂端優勢的重要激素[6-7]。外源噴施生長素能顯著影響分枝的形成[8]。生長素含量的極性分布對植物分枝角度的形成具有重要調控作用[9]。植物中生長素的局部濃度主要受合成、代謝和運輸的影響,其中結合態生長素和游離態生長素的動態平衡對植物局部生長素含量至關重要[10]。生長素酰胺水解酶(IAA-leucine resistant1-like hydrolase,ILR1-like hydrolase,ILL)基因所編碼的酶能催化氨基酸結合態生長素轉化為游離態生長素[11]。生長素酰胺水解酶基因最早在擬南芥中分離得到[12],擬南芥中共有7個ILL基因,IAA-Leu 和 IAA-Phe為AtILR1基因的主要作用底物,IAA-Ala為基因AtIAR3和AtILL2的主要作用底物[13]。桃中共鑒定到9個ILL基因,且PpILR1可能參與調控桃果實成熟[14],但桃ILL基因對樹型形成相關因素的影響至今鮮有報道。

生長素在植物整個生長發育過程中發揮重要的調控作用,包括植物器官形成、頂端優勢保持、分枝角度形成等過程[15-16]。生長素響應因子(auxin response factor, ARF)是生長素下游的發揮重要調控作用的轉錄因子,在生長素信號轉導過程中具有核心調控作用[17]。ARF轉錄因子可與生長素響應元件TGTCNN特異性結合,進而調控生長素下游基因的表達[18]。水稻OsARF19轉錄因子結合在OsGH3-5基因啟動子上并促進其表達,以減少游離態生長素含量,最終使水稻葉角顯著增加[19]。水稻OsARF12、OsARF17和OsARF25基因通過調節生長素的再分布進而調控水稻分蘗角度的形成[20]。目前,隨著基因組序列的釋放,ARF基因已經在多種植物中分離鑒定。其中擬南芥中共鑒定到22個ARF基因[21],番茄中共鑒定到22個ARF基因[22],水稻中鑒定到25個ARF基因[23],甜橙中鑒定到19個ARF基因[24],香蕉中鑒定到47個ARF基因[25],在桃中共分離鑒定17個ARF基因,并且這些ARF基因廣泛參與桃果實的生長發育[26]。然而,ARF基因是否參與調控桃樹型的形成目前仍不清楚。

本研究以分枝角度小的柱型桃‘灑紅龍柱’為試驗材料,克隆桃基因生長素酰胺水解酶基因PpILR1的CDS區域,構建過表達載體穩定轉化micro-Tom番茄驗證PpILR1基因功能;同時通過轉錄組分析篩選到響應NAA處理的基因PpARF4和PpARF8A,并通過酵母單雜交和雙熒光素酶試驗驗證轉錄因子PpARF4和PpARF8A對PpILR1基因啟動子的調控關系,研究結果可為桃樹型遺傳改良工作提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用材料柱型桃‘灑紅龍柱’定植于河南農業大學毛莊科教園區。

用于雙熒光素酶試驗的本氏煙草(Nicotianabenthamiana)和基因功能驗證的micro-Tom番茄均為河南農業大學桃生物學與種質創新團隊保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 桃PpILR1、PpARF4和PpARF8A基因克隆 使用植物總RNA提取試劑盒(B518631-0100,上海生工)提取‘灑紅龍柱’桃葉片RNA,并用 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047B9(A×4),Takara)試劑盒將桃總RNA反轉錄為cDNA。以桃PpILR1基因(Prupe.7G100000)的編碼序列為模板,用Primer premier 5.0軟件設計PpILR1基因特異性引物(表1)擴增其CDS序列。PCR反應體系為:cDNA1 μL(200 mg·L-1),高保真酶10 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,ddH2O補足至20 μL,PCR反應程序為:預變性98 ℃,30 s;變性98 ℃,10 s;退火55 ℃,5 s,延伸72 ℃,15 s;終延伸72 ℃,60 s,35個循環。PCR擴增產物瓊脂糖電泳之后用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit(DC301-01,南京諾唯贊)試劑盒進行切膠回收,純化產物連接平末端載體 pEASY?-BluntVector(CB101-01,北京全式金)并轉化DH5α大腸桿菌感受態,置于37 ℃培養箱中培養,PCR驗證陽性的單克隆送至北京擎科生物技術有限公司測序?；騊pARF4(Prupe.6G097700)和PpARF8A(Prupe.3G182900)的編碼序列擴增方法如PpILR1,引物序列參照表1。

表1 PpILR1基因克隆、調控、表達和功能分析所用引物

1.2.2 桃PpILR1基因過表達載體的構建 以構建成功的PpILR1平末端載體為模板,利用PpILR1-SAK同源臂引物(表1)擴增CDS序列,PCR擴增體系和程序如1.2.1。提取過表達空載體pSAK-277,并用限制性內切酶KPNⅠ和XhoⅠ進行雙酶切。酶切反應體系為:載體5 μL(200 mg·L-1),內切酶KPNⅠ 1 μL,內切酶XhoⅠ 1 μL,buffer 5 μL,ddH2O 補足至50 μL。酶切產物及PCR產物瓊脂糖電泳后用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit (DC301-01,南京諾唯贊)試劑盒切膠回收,純化后的產物用于同源重組構建PpILR1基因的過表達載體。同源重組體系:pSAK-277載體PCR純化產物 2 μL,同源臂引物擴增的目的基因 1 μL,重組酶2 μL, buffer 4 μL,ddH2O 補足至 20 μL,在溫度37 ℃條件下重組0.5 h。轉化大腸桿菌和陽性檢測如1.2.1。將測序正確的過表達載體PpILR1-SAK于-20 ℃條件下保存備用。

1.2.3 桃PpILR1穩定轉化番茄及表型分析 番茄穩定轉化方法參照SUN等[27]的方法。將構建成功的PpILR1-SAK過表達載體轉化為農桿菌GV3101,鑒定陽性后接種至培養基中過夜培養,隨后用MS培養基重懸菌液并調整菌液濃度為OD600=0.3～0.5以備后續番茄葉片侵染。選取完全展開的micro-Tom番茄組培苗幼葉,用解剖刀將葉片切割成2～3段,暗培養2 d后用于侵染。將暗培養之后的番茄葉片懸浮在上述農桿菌菌液中,侵染3～4 min。將侵染后的番茄葉片用滅菌水清洗3～5遍,共培養2 d后轉移到篩選培養基中進行培養,并提取愈傷上長出的番茄植株DNA進行陽性鑒定?？剐耘囵B基上篩選的番茄移栽21 d后,取番茄葉片并用基因組提取試劑盒(DNE36-02,北京諾貝萊)提取植物DNA,并以其為模板進行PCR擴增驗證陽性,PCR擴增體系及程序如1.2.1。番茄葉片RNA提取及反轉錄參照1.2.1。以獲得的cDNA為模板用試劑盒SYBR Select Master Mix(Applied Biosystems,Mardrid,CA,USA)對轉基因番茄PpILR1進行表達量分析。使用的儀器為ABI PRISM 7500 FAST Sequence Detection System(Applied Biosystems,Mardrid,CA,USA)。定量PCR體系:SYBR 10 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,cDNA模板1 μL,ddH2O 7 μL。定量PCR反應程序:50 ℃ 2 min;95 ℃ 2 min;95 ℃ 5 s,60 ℃ 35 s,40個循環。番茄內參基因為Solyc04g011500,采用2-ΔΔCt計算PpILR1基因相對表達量。引物序列詳見表1。

T2代轉基因番茄及野生型番茄WT移栽溫室42 d后,分別選取長勢良好且一致的番茄用SC-K1 原位活體植物分枝角自動測量儀系統(杭州萬深)統計一級分枝基角角度。設置3個生物學重復,每個重復至少包含3棵番茄苗。

1.2.4 轉錄組測序及熱圖分析 2020年4月,選取生長狀態一致的多年生‘灑紅龍柱’枝條用40 mg·L-1外源NAA整株噴施處理,設置3個重復,每個重復至少含3個枝條,以噴施清水為對照。采集處理組和對照組處理后0、2 h的分枝連接處韌皮部液氮冷凍后送至上海華大基因科技有限公司用于轉錄組測序。利用測序獲得NAA處理組和對照組的 RNA-Seq數據采用 TBtools[28]軟件繪制熱圖。

1.2.5 酵母單雜交試驗 依據PAbAi載體多克隆位點,設計包含載體序列的同源臂引物(表1)擴增基因PpILR1的啟動子序列(-1.5 kb)。PCR擴增體系和擴增程序如1.2.1。用限制性內切酶Hind Ⅲ和Xho Ⅰ進行雙酶切,酶切體系如1.2.2。酶切后產物和PCR擴增產物用試劑盒進行切膠回收,回收后產物用于同源重組,同源重組體系如1.2.2。PpARF4-AD和PpARF8A-AD重組載體構建PAbAi-PpILR1,AD載體的酶切位點為NdeⅠ和XhoⅠ。酵母單雜交試驗操作步驟參照A MatchmakerTMGold Yeast One-Hybrid Library Screening System Kit (630491, Clontech, San Francisco, CA, USA)試劑盒說明書。

1.2.6 雙熒光素酶試驗 雙熒光素酶試驗方法參照HELLENS等[29]的方法。依據載體pGreen0800-Ⅱ的多克隆位點和PpILR1基因的啟動子序列(-1.5 kb),設計同源臂引物(表1)擴增基因PpILR1的啟動子序列。pGreen0800-Ⅱ用限制性內切酶KpnⅠ和XhoⅠ進行雙酶切,酶切體系如1.2.2。酶切后的PCR產物和PpILR1擴增產物用試劑盒切膠回收之后用于同源重組,同源重組體系如1.2.2。PpARF4-SAK和PpARF8A-SAK重組載體構建過程同pGreen0800-PpILR1,SAK載體酶切位點為KpnⅠ和XhoⅠ。將構建成功的重組質粒pGreen0800-PpILR1、PpARF4-SAK和PpARF8A-SAK分別轉化農桿菌GV3101,用農桿菌介導的遺傳轉化法瞬時轉化本氏煙草葉片。將pGreen0800-PpILR1和PpARF4-SAK(或PpARF8A-SAK)調至菌液濃度為OD600=0.6～0.7,室溫靜止2～3 h后用于侵染煙草葉片,pGreen0800-PpILR1和空載SAK組合為對照組。煙草葉片侵染3 d后用于LUC和REN測定,具體測定方法參照Dual-luciferase assay kit (E1980, Promega, Madison, USA)試劑盒說明書。

1.2.7 數據統計與分析 差異顯著性分析軟件為SPSS 17.0,用Excel 2010統計數據并作圖。

2 結果與分析

2.1 PpILR1轉基因番茄的PCR和qPCR檢測

用測序正確的平末端重組PpILR1-pEASY載體為模板構建PpILR1基因過表達載體并送北京擎科生物技術有限公司測序,提取測序成功的過表達載體PpILR1-pSAK277并轉化農桿菌GV3101,借助農桿菌介導遺傳轉化方法侵染野生型Micro-Tom番茄,用含50 mg·L-1卡那霉素的MS培養基進行抗性植株的篩選,移栽28 d后提取葉片DNA,用PpILR1基因的特異性引物進行PCR擴增,結果顯示,獲得的14株番茄植株均能擴增出條帶,而陰性對照野生型番茄不能擴增出條帶(圖1-A),表明PpILR1已經成功整合到番茄基因組中。提取轉基因陽性苗葉片總RNA用于熒光定量PCR分析(圖1-B)。結果表明,14株轉基因株系PpILR1相對表達量均顯著高于野生型番茄,且株系PpILR1-9和PpILR1-14相對表達量最高,故后續試驗選取PpILR1-9和PpILR1-14株系的T2代做進一步分析。

注：M為marker;WT為野生番茄;1～14為轉基因番茄株系?！?*” 表示在p<0.01條件下差異顯著。

2.2 PpILR1轉基因番茄株系的分枝角度分析

選擇PpILR1基因相對表達量最高的2個株系PpILR1-9和PpILR1-14的T2代轉基因植株進行表型分析。與野生型番茄相比,轉基因株系PpILR1-9和PpILR1-14分枝角度變小(圖2-A),且轉基因株系的株冠顯著小于野生型番茄(圖2-B)。野生型番茄分枝角度的平均值為79.1°,而轉基因番茄株系PpILR1-9和PpILR1-14分枝角度的平均值分別為50.3°和54.3°(圖2-C)。

注：圖A、圖B為WT和轉基因株系PpILR1-9、PpILR1-14正面圖和俯視圖。C為PpILR1-9、PpILR1-14分枝角度顯著小于WT?！?*”表示在p<0.01條件下差異顯著。

2.3 外源NAA處理對PpARFs基因轉錄的影響

通過序列比對分析,從桃基因組中鑒定到17個ARF轉錄因子,其命名參照DIAO等的方法[26]。為明確17個PpARF基因是否響應NAA處理,用40 mg·L-1NAA處理多年生‘灑紅龍柱’桃,并取處理0和2 h分枝連接處韌皮部用于轉錄組測序。熱圖分析結果表明,17個PpARF基因中,基因PpARF4、PpARF8A、PpARF8B和PpARF12響應NAA處理,且基因PpARF4和PpARF8A表達量顯著上調(圖3)。

注：CK表示NAA處理0 h的‘灑紅龍柱’桃分枝連接處;NAA treatment表示NAA處理2 h的‘灑紅龍柱’桃分枝連接處。

2.4 PpARF4和PpARF8A與PpILR1啟動子互作關系分析

PpILR1啟動子元件分析結果表明,PpILR1啟動子區域含有ARF結合元件TGTGNN,且基因PpARF4和PpARF8A響應NAA處理。表明轉錄因子PpARF4和PpARF8A可能結合PpILR1啟動子。酵母單雜交試驗進一步驗證該推測,當培養基中不含金擔子素(AbA)時,對照組(空載AD載體和PpILR1-PAbAi)和試驗組(PpILR1-PAbAi和PpARF4-AD、PpARF8A-AD)均能正常生長,而當培養基中加入150 ng·mL-1AbA時,僅試驗組能夠正常生長(圖4)。結果表明轉錄因子PpARF4和PpARF8A能結合PpILR1啟動子。

Positive control:陽性對照;AD+PpILR1:AD空載質粒和PpILR1-PAbAi;PpARF4+PpILR1:PpARF4-AD和PpILR1-PAbAi;PpARF8A+PpILR1:PpARF8A-AD和PpILR1-PAbAi;AbA:金擔子素A;

2.5 煙草瞬時分析PpARF4和PpARF8A對PpILR1啟動子活性的影響

為明確轉錄因子PpARF4和PpARF8A對PpILR1啟動子活性的影響,克隆PpILR1啟動子序列,并構建PpILR1-pGreen0800載體,克隆基因PpARF4和PpARF8A編碼區序列構建過表達載體用于煙草瞬時試驗。雙熒光素酶試驗結果顯示,PpARF4和PpARF8A為轉錄抑制子,與對照組相比,能顯著抑制PpILR1啟動子活性。對照組(空載pSAK277和PpILR1-pGreen0800)LUC/REN比值為0.062,試驗組(35S-PpARF4與PpILR1-pGreen0800、35S-PpARF8A與PpILR1-pGreen0800)的LUC/REN比值分別為0.013和0.025(圖5)。

Control表示SAK空載;“**”表示在p<0.01水平差異顯著。

3 結論與討論

植物樹(株)型直接影響其栽培密度、果實產量、果實品質等,分枝角度是影響植物樹(株)型建成的重要因素之一。普通型桃分枝角度大,樹型開張,隨著結果年限的推移,樹體枝繁葉茂,直接影響通風透光、果實品質,還加重病蟲害發生概率[30]。柱型桃因其分枝角度小、樹冠小、側枝數量少等特點受到育種工作者的青睞。發掘控制桃分枝角度相關基因,通過分子育種手段對現有主栽桃品種樹型進行改良具有重要意義。

本研究從柱型桃‘灑紅龍柱’克隆PpILR1基因的編碼區并穩定轉化micro-Tom番茄,與野生型番茄相比,轉基因番茄分枝角度顯著減小。目前鑒定的與分枝角度形成相關的基因主要有LAZY1和TAC1[31-32]。LAZY1基因表達上調則植物分枝角度小,反之則分枝角度變大。LAZY1可通過調控蛋白PIN3的膜定位進而影響植物體內的生長素極性運輸過程,最終參與調節植物分枝角度形成過程[33-34]。并且有研究表明,TAC1基因可能也是通過影響生長素在植物體內的分布進而影響分枝角度[35]。生長素在植物體內有2種存在形式,即游離態生長素和結合態生長素,僅游離態生長素具有正?；钚?。生長素酰胺水解酶家族蛋白能水解氨基酸結合態生長素的酰胺鍵并釋放具有生物活性的游離態生長素,進而調節植物組織中的游離態生長素含量[13]。有研究表明,桃PpILR1基因能水解結合態生長素IAA-Leu和IAA-Ala,并釋放游離態生長素IAA[36],推測PpILR1基因可能通過增加植物組織局部具有正常生物活性游離體態生長素的含量,進而影響植物分枝角度的形成。

ARF為生長素重要響應因子,可通過生長素響應元件TGTCNN結合并調控生長素下游基因的表達。ARF蛋白家族含有3個保守結構域,即DNA結合結構域(DBD),中部的中間結構域(MR)和具二聚化作用的二聚結構域(RD)。ARF基因編碼的蛋白能識別并結合在生長素響應基因的啟動子上,并調控這些基因的表達。ARF基因在植物的整個生長發育過程中發揮重要調控作用。在擬南芥中,基因AtARF7和AtARF19調控根部生長點的形成[37];AtARF5基因調控擬南芥葉原基的形成[38];基因AtARF6和AtARF8調控擬南芥花器官的形成[39];AtARF10基因影響擬南芥分枝的再生能力[40]。同時,ARF轉錄因子對植物分枝角度的形成也具有重要調節作用,在水稻中,轉錄因子OsARF19結合并促進生長素酰胺合成酶OsGH3-5基因表達,而OsGH3-5可使具生物活性的游離態生長素轉化為氨基酸結合態生長素,進而減少植物組織生長素含量并調節分枝角度[19]。本研究發現,在桃中,與對照組相比,外源NAA處理能顯著增加基因PpARF4和PpARF8A的表達水平,且轉錄因子PpARF4和PpARF8A能結合并調控基因PpILR1的表達,表明轉錄因子PpARF4和PpARF8A可能通過調控PpILR1基因的表達進而參與調控植物分枝角度形成過程,可為桃樹型的遺傳改良工作提供理論支持。