烏蒙烏骨雞 Myf5基因多態性與生長體重的關聯分析

王文濤, 田旭玲, 張福平*

(1. 清鎮市農業農村局,貴州 清鎮 551400;2. 貴州大學動物科學學院,貴州 貴陽 550025)

烏蒙烏骨雞是主產于貴州西北烏蒙山區畢節市、大方縣、納雍縣、水城區等區域的地方特色家禽品種,因皮膚、肌肉、骨及內臟等均為烏黑色而得名,2009 年被列入中國家禽品種目錄,是我國家禽品種基因庫中具有較高經濟價值的蛋肉兼用型品種,肉質鮮美細嫩,但生產性能比快大型雜交雞低。Myf5基因是1類具有bHLH(堿性螺旋—環—螺旋)結構的轉錄因子,在動物早期胚胎中的表達與肌肉形成過程密切相關,其基因表達可促進動物胚胎期肌肉的形成,出生后表現為肌纖維長度增加和周徑增大[1]。此外Myf5基因也在成肌細胞分化過程中起著重要的調控作用?；蚯贸龑嶒灡砻?小鼠的Myf5基因失活可導致其缺乏肌生成素,而未敲除Myf5基因的小鼠胚胎可以產生正常數量的成肌細胞[2]。目前畜禽育種繁殖領域對Myf5基因的研究主要集中在其與家畜周齡性狀的關聯性研究方面,與家禽周齡和繁殖性狀相關的研究較少[3～5]。對松遼白鵝的研究揭示Myf5基因第1外顯子發生單堿基突變形成3種基因型,不同基因型的宰前活重、屠體重、半凈膛重、全凈膛重、腿肌重等性狀差異顯著[6]。孫文浩[7]研究顯示,自主培育的優質雞Myf5基因第1外顯子存在2個SNP位點,不同單倍型組合對肌纖維密度和直徑具有顯著影響(P<0.05)。本試驗以烏蒙烏骨雞為研究對象,探究Myf5基因突變位點與生長體重的關聯性。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

在貴州省畢節市納雍縣種雞場-貴州省地方雞遺傳資源庫選取同批次、相同環境條件下飼養的18周齡烏蒙烏骨雞100只(公、母各50只)作為試驗雞。

1.2 血樣采集

用肝素鈉抗凝采血管在翅靜脈采血2 mL,放置于冰盒中暫存,帶回實驗室于 -80 ℃冰箱內保存備用,用于提取DNA。

1.3 主要試劑及儀器

(1)主要試劑:血清DNA提取試劑盒(型號:FG0309-A004,北京凡知公司)、DL 2 000 DNA Marker(上海生工生物工程技術服務有限公司)。(2)主要儀器:由貴州大學動物科學學院實驗室提供(見表1)。

表1 試驗用主要儀器

1.4 試驗方法

1.4.1 DNA提取

用血清DNA提取試劑盒提取烏蒙烏骨雞血液基因組DNA,置于 -20 ℃冰箱中保存備用。

1.4.2 引物設計

根據GenBank中雞Myf5基因序列(登錄號:NC052532.1),利用National Center for Biotechnology Information系統設計2對引物(見表2),用于擴增Myf5基因第1外顯子。引物由北京擎科生物有限公司合成,離心后加入雙蒸水溶解,保存于 -4 ℃冰箱中備用。

表2 引物信息

1.4.3 PCR 擴增

PCR反應體系25 μL:模板 DNA 2 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,Mix(10 mmol/L)21 μL。反應條件:98 ℃預變性2 min;98 ℃變性10 s,59 ℃退火10 s,72 ℃延伸12 s,共32個循環。擴增產物4 ℃保存。

1.4.4 DNA測序

用1%瓊脂糖凝膠電泳(120 V,30 min)檢測 PCR 產物,將特異性較好的擴增產物送至北京擎科生物有限公司測序。

1.4.5 體重測定

每只試驗雞每2周(初生、2周齡、4周齡、6周齡、8周齡、10周齡、12周齡、14周齡、16周齡、18周齡)使用檢重秤測定早飼前的空腹體重,結果以“平均值±標準差”表示。

1.4.6 數據統計

利用SHEsis軟件logistics回歸法計算烏蒙烏骨雞Myf5基因多態位點的基因型和等位基因頻率、純合度Ho、雜合度He、有效等位基因數Ne、多態性信息含量PIC,用SPSS 21.0軟件卡方檢驗法進行Hardy-Weinberg平衡檢驗,并對Myf5基因多態位點進行配對連鎖不平衡分析、不同基因型與周齡體重關聯性分析。

2 結果與分析

2.1 Myf5基因PCR擴增結果

PCR擴增出特異條帶,與預期擴增長度相符(見圖1)。

M:DL 2 000 DNA Marker;1:引物1;2:引物2圖1 Myf5 基因PCR 擴增結果

2.2 SNP突變位點分析

測序表明,烏蒙烏骨雞Myf5基因第1外顯子有2個SNP位點,分別為G.40098556 突變位點,堿基C突變為堿基T(C

圖2 Myf5基因G.40098556(C

圖3 Myf5基因 G.40098586(A

表3 Myf5 基因SNP位點基因型頻率、等位基因頻率分析

2.3 Myf5 基因型與生長體重關聯性分析

分析結果顯示,烏蒙烏骨雞Myf5基因第1外顯子G.40098556存在1個C0.05)(見表4)。

表4 Myf5基因G.40098556(C

表5 Myf5基因G.40098586(A

3 結論

烏蒙烏骨雞Myf5基因第1外顯子存在2個SNP突變位點:G.40098556(C

4 討論

Myf5是生肌調節因子家族成員之一,在胚胎早期肌肉的形成過程中決定成肌細胞的特化和成肌的起始,參與肌肉的形成。本研究在烏蒙烏骨雞Myf5基因第1外顯子發現2個突變位點,其中 G.40098586(A