牛支原體的分離培養與分子生物學鑒定

胡 茜, 趙 超, 王永璇, 羅小芬, 冉芳菲, 成虹松, 朱二鵬,2, 牟真權, 程振濤,2*

(1. 貴州大學動物科學學院,貴州 貴陽 550025;2. 貴州省動物疫病與獸醫公共衛生重點實驗室,貴州 貴陽 550025;3. 德江縣平原鎮農業服務中心畜牧站,貴州 德江 565200)

牛支原體屬于原核生物,兼性厭氧,無細胞壁,體外培養周期較長,且對營養條件的要求較高,條件適宜時可觀察到“煎蛋”樣菌落[1,2]。牛支原體感染可引起以肺炎為主的臨床癥狀,導致關節、結膜、乳腺、耳道等多處發生炎癥,并能誘發妊娠母牛流產[3]。此外,牛支原體攻擊機體的免疫系統,增加繼發感染其他病原的概率[4]。2008年,我國首次從病牛肺臟中分離出牛支原體,此后牛支原體病在我國多個地區陸續有報道,并嚴重損害養牛業的發展[5]。牛感染呼吸道疾病的病原復雜多樣,牛支原體是其中常見且危害較大的1種,快速鑒定診斷此病并采取相應防治措施對于控制其流行和發展具有重要意義。在鑒別牛支原體的方法中,普通PCR和實時熒光定量PCR作為檢測效率較高的技術而常用于實驗室診斷[6]。2022年10月,貴州省平壩區某牛場出現發熱、氣喘病例,剖檢病死牛見肺臟有干酪樣病灶,疑似支原體感染。為確診其發病原因,本研究采集病死牛的肺臟組織進行實驗室診斷,現將相關情況報道如下。

1 材料與方法

1.1 病料采集

無菌條件下采集病死牛的肺臟組織,4 ℃冷藏送至貴州大學預防獸醫學實驗室,-20 ℃保存備用。

1.2 主要試劑

改良Hayflick液體培養基:PPLO肉湯、馬血清(均購自青島海博生物技術有限公司),酵母粉(購自英國OXOID公司),氨芐西林鈉(購自北京索萊寶科技有限公司),葡萄糖、乙酸鈉(購自成都金山化學試劑有限公司);改良Frey氏固體培養基(購自北京中海生物有限公司),柱提法病毒DNA/RNA提取試劑盒(購自哈爾濱元亨生物藥業有限公司),支原體通用型(MYCO-U)核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)(購自武漢科前生物股份有限公司),2×TaqPCR Master Mix、DL 2 000 DNA Marker(均購自大連寶生物工程有限公司);其他試劑均為國產分析純。

1.3 主要儀器

二氧化碳培養箱(型號:BPN-150CW,上海一恒科學儀器有限公司)、生物顯微鏡(型號:C33,上海普赫光電科技有限公司)、高速冷凍離心機[型號:Sorvall Legend Micro 17R,賽默飛世爾科技(中國)有限公司]、熒光定量聚合酶鏈式反應檢測系統(型號:FQD-96A,杭州博日科技股份有限公司)、基因擴增儀(型號:T20,杭州朗基科學儀器有限公司)。

1.4 病原分離培養

無菌條件下取病死牛肺臟組織加入改良Hayflick液體培養基[7],置于37 ℃搖床中培養3 d,觀察到培養基顏色由紅色轉為黃色時,無菌條件下以相同條件傳代2次。傳代完成后取菌液200 μL接種于改良Frey氏固體培養基,倒置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養3～5 d,用接種環挑取單個典型菌落接種于改良Hayflick液體培養基。重復上述操作培養純化3次,分別于 -80 ℃甘油及凍干保存菌種。

1.5 病原實時熒光定量PCR鑒定

取培養菌液1 mL,12 000 r/min離心15 min,按照柱提法病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書提取DNA作為模板。根據支原體通用型核酸檢測試劑盒說明書,設置實時熒光定量PCR反應體系25 μL:MYCO-U反應液19 μL,混合酶液1 μL,模板5 μL。反應程序:95 ℃預變性2 min;擴增95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s(此階段結束時采集熒光信號),共45個循環。判定條件:各樣品達到閾值線的循環數即為Ct值,陽性對照Ct值≤32并出現特征性擴增曲線,陰性對照無特征性擴增曲線(無Ct值),以上條件同時滿足則試驗有效,否則視為無效。當被檢樣品出現特征性擴增曲線且Ct值≤40判為陽性,被檢樣品Ct值>40或無Ct值判為陰性。

1.6 基因測序分析

參考GenBank收錄的牛支原體PG45(登錄號:CP002188.1)基因序列設計牛支原體特異引物(F:5’-ATAAAAAAATCTAACAAT-3’,Tm值35.4 ℃;R:5’-TTAGTGAACAATTAACTTGGAAT-3’,Tm值46.4 ℃;預擴增片段345 bp)進行PCR擴增。PCR反應體系20 μL:上、下游引物各1 μL,模板4 μL,Mix 10 μL,ddH2O 4 μL。反應程序:95 ℃預變性3 min;95 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共循環35次;72 ℃終延伸10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,取陽性產物送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將測序結果與GenBank中收錄的10株不同支原體參考株(見表1)進行同源性比較,繪制系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 培養菌落形態

在改良Frey氏固體培養基上可見針尖大小的單個菌落,顯微鏡下觀察呈現“煎蛋”樣菌落(見圖1),符合支原體培養特征。

圖1 改良Frey氏固體培養基上生長的菌落形態(10×10)

2.2 實時熒光定量PCR鑒定結果

由圖2可見:分離菌株Ct值為28.91,且有特征性擴增曲線,判為陽性,提示為支原體。

1:分離菌株;+:陽性對照;-:陰性對照圖2 分離菌株實時熒光定量PCR鑒定結果

M:DL 2 000 DNA Marker;1:分離菌株;+:陽性對照;-:陰性對照圖3 PCR擴增結果

2.3 基因測序結果

由圖3可見:PCR擴增出與預期片段相符的345 bp目的條帶,將分離菌株命名為GZ-PB1?；蛐蛄蟹治鼋Y果顯示,分離菌株與各牛支原體參考株的同源性均高達95.6%(見圖4),且處于同一進化分支(見圖5);與豬、羊、雞支原體參考株的同源性均小于30%,并處于不同進化分支。分離菌鑒定為牛支原體。

圖4 分離菌株與10株支原體的同源性比較

圖5 分離菌株與10株支原體的系統進化樹

3 結論

通過病原分離培養、分子生物學鑒定,診斷發病牛為牛支原體感染。

4 討論

牛支原體病的傳染源及傳播方式多種多樣,難以防范[8]。牛感染支原體病后生產性能下降,且易繼發感染其他病原造成嚴重損害,因此需及時診斷并制定隔離、治療和淘汰等措施。牛支原體的分離鑒定是常用診斷方法之一,可用于DNA提取、菌種保存、流調及分析與其他菌株的親緣關系等,但由于牛支原體在體外培養較困難、生長周期長,因此存在一定的局限性[9,10]。普通PCR方法的檢測效率、靈敏度和特異性都較高,可用于臨床樣本的快速檢測,但其耗時較長,且可能出現假陽性[11,12]。實時熒光定量PCR的靈敏度是普通PCR的4～10倍,具有檢測速度快、定量準確、靈敏度高等優點[6]。本研究通過病原分離培養初步判斷病牛為支原體感染,再結合分子生物學鑒定和遺傳進化分析,相互彌補各檢測方法的不足,快速、準確地診斷出本次感染病原為牛支原體。