miR-378通過抑制小鼠肝炎癥反應改善非酒精性脂肪性肝炎的損傷*

佘明豪 楊文輝 劉寒松 余 洋 張 磊

（鄭州大學附屬鄭州中心醫院，1 普通外科，2 消化內科，鄭州 450007）

非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）特征為肝脂肪變性和炎癥[1]。西方國家NASH的發病率為20%～45%[2-3]。據報道，慢性肝臟炎癥被認為是導致NASH發生發展的主要因素[4]。微小RNA（microRNA，miRNA）是具有18～25個核苷酸的RNA，為非編碼RNA的一種。有研究顯示，肝病患者與正常人群中miRNA表達譜存在顯著差異[5]。越來越多的證據表明miRNA在多種生物學過程和許多疾病的發病機制中發揮重要作用，如miR-33a、miR-34a和miR-24已顯示出作為NASH發展的因素，有可能成為NASH進展中肝炎的標志物[6]。目前，有研究證實miR-378在引發肝炎和促進肝纖維化中起到重要作用，其可通過核因子κB（nuclear factor κB，NFκB）-腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNFα）信號通路促進肝組織發生炎癥甚至纖維化[7]。然而其在NASH中的作用及其機制尚不明確。因此，本研究通過建立NASH小鼠模型組及miR-378干預組，探討miR-378在NASH發生及發展中的作用及其機制，為NASH的靶向治療提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級健康C57BL/6雄鼠20只，雌鼠20只，8周齡，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號SCXK （京） 2012-0001、SYXK （遼）-2010-0002。動物飼養在符合GB14925—2010《實驗動物環境及設施》有關要求的屏障環境中，12 h/12 h晝夜光照循環，動物室溫度 25℃±2 ℃，相對濕度50%±2%，自由進食、飲水。

適應性飼養1周后，將40只C57BL/6小鼠按照體質量隨機分為對照組（正常飲食組）、NASH模型組（高脂飲食組）、miR-378抑制劑組（高脂飲食+antagomir-378）、陰性抑制劑組（高脂飲食+antagomir陰性對照）。NASH模型組通過高脂飲食處理8周，其中高脂飲食包含15%的可可脂、1.25%的膽固醇但不含膽酸鹽；miR-378抑制劑組及陰性抑制劑組均每周以2 mg/kg的劑量進行尾靜脈注射miR-378抑制劑antagomir和antagomir陰性對照溶液，共6周。麻醉處死各組小鼠，取血清和肝組織，-80℃保存。

1.2 主要試劑

cDNA逆轉錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（TaKaRa，中國）；TRIzol（BBI，中國）；抑制劑miR-378 antagomir、陰性對照抑制劑（吉瑪吉因，中國）；高脂飼料（維通利華，中國）。

1.3 小鼠肝系數測定

乙醚麻醉小鼠，腹主動脈采血后處死，摘取肝，剝去周圍結締組織及脂肪組織，對肝進行稱重，計算肝系數。肝系數 （%） =肝濕重 （g） /體質量 （g）×100%

1.4 小鼠肝代謝分析

根據制造商的說明，使用Olympus AU5400自動化學分析儀檢測各組小鼠血清肝炎癥損傷指標丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）水平。

1.5 小鼠肝組織的病理學檢測

每組隨機選取3只小鼠的肝，置于4%多聚甲醛固定液中固定，1周后石蠟包埋切片（3 μm），分別采用H-E、油紅O、Masson染色試劑盒對各組肝組織進行染色，光學顯微鏡下觀察組織形態。

1.6 免疫熒光檢測肝纖維化蛋白的表達

挑選所需組織切片，常規脫蠟，置于封閉液（0.01 mol/L PBS，0.3% Triton X-100，3%山羊血清）1 h，一抗轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β，1∶500 稀釋，Abcam 公司，美國）和膠原蛋白1α2（collagen type l α2，Col1α2，1∶1 000 稀釋，Abcam 公司，美國），4℃孵育過夜。加入二抗（1∶1 000，Abcam公司，美國），室溫、避光、搖床孵育2 h。防淬滅封片劑封片，避光風干，共聚焦顯微鏡觀察、拍片記錄。

1.7 肝組織TNF-α、白細胞介素4（interleukin 4，IL-4）、白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、TGF-β和Col1α2基因表達的檢測

采用總RNA 提取分離試劑盒（TIANGEN，中國）對肝樣本進行總RNA的提取，然后將提取的miRNA通過 miRcute miRNA第一鏈合成試劑盒（TIANGEN，中國）進行cDNA的合成，按逆轉錄試劑盒反應說明書操作。通過miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒（TIANGEN，中國）對miR-378表達量進行檢測，內參基因為U6；用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒對肝組織TNF-α、IL-4、IL-6、MCP-1、TGF-β和Col1α2 mRNA表達量進行檢測，內參基因為GAPDH，依據 2-△△ct計算各miRNA及mRNA的相對表達量。引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.8 統計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。符合正態分布且方差齊性檢驗合格后，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），與對照組比較采用Dunnett 法分析；不符合則用非參數檢驗進行分析。檢驗水準α=0.05。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠肝系數及肝病理學變化

與對照組（0.0518±0.0033）g/100 g比較，NASH模型組（0.0642±0.0012）g/100 g和陰性抑制劑組（0.0594±0.0049）g/100 g的肝系數顯著升高；與NASH模型組比較，miR-378抑制劑組（0.0532±0.0024）g/100 g肝系數下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

對照組小鼠肝呈鮮紅色，表面光滑且無纖維化及脂肪浸潤；NASH模型組肝小葉結構不清，出現明顯的肝細胞壞死、脂肪及炎癥細胞浸潤，且陰性抑制劑組與之相似；然而miR-378抑制劑組肝小葉結構正常，肝細胞排列整齊，脂肪樣變已經明顯得到緩解（圖1）。

圖1 各組小鼠肝組織病理學組織形態，標尺=50 μm。A1～D1：H-E染色；A2～D2：Masson染色；A3～D3：油紅O染色。A：對照組；B：NASH模型組；C：miR-378抑制劑組；D：陰性抑制劑組.

2.2 各組肝組織miR-378表達比較

與對照組比較，NASH模型組和陰性抑制劑組miR-378表達量明顯升高（1.17±0.32比2.13±0.44，1.17±0.32比1.89±0.21），差異有統計學意義（P＜0.05）；與NASH模型組比較，miR-378抑制劑組miR-378表達量明顯下降（2.13±0.44比0.55±0.12），差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 各組血清ALT、AST水平比較

與對照組比較，NASH模型組和陰性抑制劑組ALT和AST含量明顯升高；而miR-378抑制劑組與NASH模型組比較，ALT和AST含量出現明顯下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖2）。

圖2 各組小鼠血清中AST和ALT含量比較。*P＜0.05 vs 對照組 ；△P＜0.05 vs NASH模型組.

2.4 各組肝組織炎癥因子表達比較

與對照組比較，NASH模型組和陰性抑制劑組肝組織TNF-α、IL-6 mRNA表達量明顯升高，而IL-4明顯下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）；而miR-378抑制劑組與NASH模型組比較，TNF-α、IL-6 mRNA表達量明顯下降，而IL-4明顯上升，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖3）。

2.5 各組肝組織纖維化基因及蛋白表達水平比較

NASH模型組和陰性抑制劑組與對照組比較，TGF-β和Col1α2 mRNA表達量出現明顯升高，而miR-378抑制劑組較NASH模型組明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖4）。進一步免疫熒光檢測結果顯示，NASH模型組和陰性模擬物組與對照組比較，TGF-β和Col1α2 蛋白表達量明顯升高，而miR-378抑制劑組較NASH模型組明顯下降（圖5）。

圖4 各組小鼠肝組織纖維化基因表達比較。*P＜0.05 vs 對照組；△P＜0.05 vs NASH模型組.

圖5 各組小鼠肝組織Col1α2（A1～D1）和TGF-β（A2～D2）免疫熒光表達，標尺=50 μm。A：對照組；B：NASH模型組；C：miR-378抑制劑組；D：陰性抑制劑組.

3 討論

NASH是一種嚴重的肝臟疾病，可通過炎癥壞死、不同程度的纖維化進而發展成為肝硬化甚至肝癌[6]。越來越多的研究表明，NASH中大量的miRNA表達異常，提示miRNA可能是NASH潛在的生物標志物和治療靶點[8]。Kim等[9]報道miR-122在非酒精性脂肪性肝炎小鼠血清中顯著增加，提示miR-122可能是早期檢測肝毒性的潛在敏感生物標志物。Loyer等[10]研究顯示miR-21在NASH中上調并抑制過氧化物酶體增長因子活化受體α的表達。盡管越來越多的數據表明miRNA在NASH中扮演重要角色，但NASH中miRNA具體的調控機制及作用靶點尚不明確。

miRNA通過與靶基因不完全互補結合的方式影響靶基因表達，進而發揮其生物學功能[11]。miRNA具有高度保守性及表達特異性等特點，因此其在不同物種間的差異較小，故可能有潛力成為疾病診斷及靶向治療的分子標志物[12]。目前，有研究證實miR-378在引發肝炎癥和促進肝纖維化中起重要作用[7]。本研究通過建立NASH模型，結果顯示NASH模型組miR-378的表達量出現明顯升高，進一步驗證了miR-378在NASH中扮演重要角色。

ALT和AST是反映肝功能的重要指標之一，其含量升高往往是肝功能出現損傷的重要標志[13]。TNF-α、IL-6、MCP-1和IL-4是重要的炎癥因子或抗炎因子，是反映肝組織損傷的指標[14-16]。本研究通過組織形態學觀察結合生物化學指標及相關因子表達檢測miR-378對NASH的作用及是否產生治療作用進行驗證，結果顯示TNF-α、IL-6和IL-4在miR-378抑制劑組與NASH模型組比較發生顯著改變，然而MCP-1雖有下降趨勢但差異無統計學意義，其可能由于治療時間較短未導致明顯改變有關，也可能是MCP-1和其受體C-C趨化因子受體-2相互作用是促進早期肝炎癥反應的因子，并且MCP-1在肝中的作用是雙重的有關。在損傷反應中，肝細胞和Kupffer細胞分泌MCP-1導致單核細胞和巨噬細胞浸潤肝。巨噬細胞分泌TNF-α和干擾素-γ，促進炎癥和肝細胞死亡，同時清除壞死細胞，可協助肝重塑和恢復正常肝功能。但相關炎癥因子mRNA水平的改變說明miR-378具有治療NASH炎癥的作用。而ALT和AST的含量在miR-378抑制劑組也出現明顯下降，且結合病理形態指標，說明低表達miR-378的NASH模型肝損傷出現了明顯好轉。肝組織纖維化是NASH加重的一項重要指標[8]。因此，本研究進一步探討miR-378對肝組織纖維化的影響。結果顯示，miR-378抑制劑組與NASH模型組比較，TGF-β和Col1α2 mRNA表達量出現明顯下降。TGF-β 和Col1α2 是肝組織纖維化中2個重要的相關因子，提示抑制miR-378能夠延緩甚至逆轉纖維化的進程，與Zhang等[7]的研究相似。

綜上所述，本研究結果表明miR-378是NASH的危險因素，抑制miR-378的表達能夠有效減緩NASH小鼠肝組織纖維化的進程，進而減緩或阻斷其進展為肝硬化的可能。