5-氨基乙酰丙酸采用醇質體包載前后的穩定性*

羅國平,閆夢茹,孟會寧,楊婭琳

(1.西安醫學院 藥學院,陜西 西安 710021;2.西安步長醫藥銷售有限公司,陜西 西安 710021)

5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid hydrochloride,5-ALA)是一種親水性的小分子化合物,屬于內源性活性物質,為第二代光敏劑,已廣泛應用于腫瘤、痤瘡及病毒性和炎癥性疾病[1-4]。5-ALA穩定性較差,溫度、光照和介質pH均會對其穩定性產生影響[5],特別是在堿性條件下,可自發不可逆的降解而失去藥理作用;另外,5-ALA為親水性藥物,經皮和黏膜的滲透性較差,這些缺陷限制了5-ALA的臨床應用?；诖?采用醇質體包載5-ALA。醇質體是由磷脂、水和高濃度醇組成的具有囊泡結構的新型脂質體[6-8],水溶性藥物包載于醇質體的內水相,除可增加藥物的脂溶性,提高透皮和透黏膜的性能外,還可提高藥物的穩定性[9-10]。作者主要對5-ALA采用醇質體包載前后的穩定性變化進行對比分析和研究。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

5-氨基乙酰丙酸鹽酸鹽：純度99%,上海麥克林生化科技有限公司;大豆卵磷脂：藥用級,磷酸二氫鉀、磷酸：分析純,乙腈：色譜純,天津市科密歐化學試劑有限公司;膽固醇：藥用級,東巨榮生物工程有限公司;無水乙醇、1,2-丙二醇：分析純,天津永晟精細化工有限公司;氫氧化鈉：分析純,天津市化學試劑公司;甲醇：色譜純,天津市大茂化學試劑廠。

高效液相色譜儀：Agilent Tech.1260,美國安捷倫科技有限公司;集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S,鞏義市予華儀器有限責任公司;電子天平：BT125 d,賽多斯科學儀器(北京)有限公司;臺式高速離心機：TG-1650-WS,上海盧湘儀離心機儀器有限公司;超聲波清洗機：SB-5200DT,寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 5-ALA醇質體的制備

采用pH梯度-乙醇注入法[11-13],精密稱取240 mg大豆卵磷脂和40 mg膽固醇,置于100 mL燒杯中,加10 mL無水乙醇超聲溶解;在避光條件下,將5-ALA溶解于20 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH=2.0)中,n=100 r/min攪拌下用注射器緩慢勻速注入到上述乙醇溶液中,繼續攪拌10 min,加氫氧化鈉溶液調至pH=7.4,再攪拌20 min,最后250 W、40 kHz超聲處理3 min,即得。

1.2.2 HPLC法測定5-ALA的相對含量

1.2.2.1 溶液的配制

(1)ρ(磷酸二氫鉀)=13.6 mg/mL(pH=2.0)溶液的配制

稱取6.8 g磷酸二氫鉀固體粉末,加純化水溶解并定容至500 mL,磷酸調至pH=2.0,即得。

(2)對照品溶液的配制

精密稱取5-ALA對照品20 mg,置于25 mL棕色容量瓶中,加ρ(磷酸二氫鉀)=13.6 mg/mL(pH=2.0)溶液溶解并定容至刻度,搖勻,避光冷藏,即得。

(3)供試品溶液的配制

取1.2.1方法制備的5-ALA醇質體混懸液4 mL,n=15 000 r/min離心15 min,沉淀加入4 mL甲醇,250 W、40 kHz超聲處理10 min,離心,上清液過0.45 μm微孔濾膜,取續濾液,即得。

(4)空白溶液的配制

按照1.2.1方法制備不含藥物的空白醇質體,再按照1.2.2.1(3)方法進行操作,即得。

1.2.2.2 5-ALA吸收波長的選擇

將5-ALA對照品溶液用紫外分光光度計在200～800 nm進行掃描。

1.2.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相：V(乙腈)∶V(磷酸二氫鉀)=3∶97;柱溫：25 ℃;波長：265 nm;流速：1 mL/min;進樣體積：20 μL[14-15]。

1.2.2.4 專屬性實驗

分別取上述對照品溶液、供試品溶液和空白溶液注入液相色譜儀,記錄色譜圖。

1.2.2.5 線性關系考察

精密吸取對照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、3.0 mL,置于10 mL容量瓶中,用流動相稀釋并定容至刻度,得到系列不同質量濃度的對照品溶液。精密吸取上述溶液20 μL注入液相色譜儀,記錄峰面積,以峰面積(A)為縱坐標,質量濃度(ρ,mg/mL)為橫坐標進行線性回歸。

1.3 不同因素對原料藥和醇質體中5-ALA相對含量的影響

1.3.1 介質pH

精密稱取5-ALA對照品3份,置于10 mL棕色容量瓶中(用錫紙包裹),加pH=2.0、7.4、10.0的PBS溶液溶解并定容至刻度,t=0、6、12、24、48、72 h取樣,測定介質中藥物的質量并計算相對含量;將制備的醇質體分成18份,置于10 mL棕色容量瓶中(用錫紙包裹),用pH=2.0、7.4、10.0的PBS溶液中進行分散(每種介質各6份),t=0、6、12、24、48、72 h取樣(每種介質每個時間點各取1份),按照1.2.2.1(3)方法處理,測定醇質體中藥物的質量并計算相對含量,以藥物的相對含量對時間作圖。相對含量的計算見公式(1)。

相對含量=mt/m0×100%

(1)

式中：mt為t時樣品中藥物的質量,mg;m0為樣品中藥物的初始質量,mg。

1.3.2 溫度

精密稱取5-ALA對照品3份,置于10 mL棕色容量瓶中(用錫紙包裹),加pH=7.4的PBS溶液溶解并定容至刻度,t=25、37、43 ℃置于水浴鍋中,t=0、6、12、24、48、72 h取樣,測定介質中藥物的質量并計算相對含量;將制備的醇質體分成18份,置于10 mL棕色容量瓶中(用錫紙包裹),用pH=7.4的PBS溶液進行分散,t=25、37、43 ℃置于水浴鍋中(每種介質中各6份),t=0、6、12、24、48、72 h取樣(每個溫度每個時間點各取1份),按照1.2.2.1(3)方法處理,測定醇質體中藥物的質量并計算相對含量,以藥物的相對含量對時間作圖。

1.3.3 光照

精密稱取5-ALA對照品2份,置于25 mL無色容量瓶和棕色容量瓶中(后者用錫紙包裹),加pH=7.4的PBS溶液溶解并定容至刻度,自然光和避光條件下,t=0、6、12、24、48、72 h取樣,測定介質中藥物的質量并計算相對含量;將制備的醇質體分成12份,置于25 mL無色容量瓶中,加pH=7.4的PBS溶液進行分散,自然光和避光條件下(各6份),t=0、6、12、24、48、72 h取樣(每個時間點各取1份),按照1.2.2.1(3)方法處理,測定醇質體中藥物的質量并計算相對含量,以藥物的相對含量對時間作圖。

2 結果與討論

2.1 HPLC法測定5-ALA的相對含量

2.1.1 5-ALA吸收波長的篩選

5-ALA對照品溶液的吸收光譜見圖1。

λ/nm圖1 5-ALA光譜掃描圖

由圖1可知,5-ALA在265 nm有最大吸收。

2.1.2 專屬性實驗

HPLC色譜圖見圖2。

t/min圖2 HPLC色譜圖

由圖2可知,供試品溶液中5-ALA的色譜峰與雜質峰之間能得到很好的分離,且輔料對主藥的測定無干擾,方法專屬性良好。

2.1.3 線性關系考察

回歸方程為y=66.41x+22.131,r=0.999 3,說明ρ(5-ALA)=0.103 5～0.798 4 mg/mL線性關系良好。

2.1.4 醇質體中藥物的包封率測定

醇質體中5-ALA的包封率測定為85.21%,說明包封率較高[16]。

2.2 不同因素對原料藥和醇質體中5-ALA相對含量影響的對比分析

2.2.1 介質pH

介質pH對原料藥和醇質體中5-ALA相對含量的影響見圖3。

t/ha pH=2.0

由圖3可知,t=144 h、pH=2.0、7.4、10.0,原料藥中5-ALA相對含量分別為40.1%、25.6%、13.3%,醇質體中5-ALA為49.3%、43.7%和36.0%。二者中5-ALA的相對含量均隨著時間的增加而降低,且pH值越高,相對含量降低速度越快,說明5-ALA在酸性介質中穩定好,在堿性介質中易降解;pH值相同,醇質體中5-ALA的降解速度幾乎均小于原料藥中5-ALA的降低速度,且隨著pH值的升高差異性越大,說明5-ALA被醇質體包載后穩定性有一定程度的增加,特別是在堿性介質中,可有效降低5-ALA的降解。

2.2.2 溫度

溫度對原料藥和醇質體中5-ALA相對含量的影響見圖4。

t/ha t=25 ℃

由圖4可知,t=72 h,t=25、37、43 ℃,原料藥中5-ALA相對含量為42.1%、28.9%和6.7%,醇質體中5-ALA為58.2%、37.0%和8.8%。在相同溫度下,隨時間的推移,二者的相對含量均下降,且隨溫度升高,5-ALA的降解速度呈加速趨勢,t=43 ℃,5-ALA降解非常明顯;對比分析原料藥和醇質體中5-ALA降解情況,t=25、37 ℃有較大差異,且醇質體中5-ALA穩定性更好一些,t=43 ℃無顯著差異,分析原因,醇質體的相變溫度tm=40～42 ℃,由于25、37 ℃低于相變溫度,醇質體能較好包載5-ALA,因此降解速度比原料藥慢一些;43 ℃高于相變溫度,醇質體發生破囊,包載其中的5-ALA將迅速釋放到介質中并發生快速降解,其降解情況與原料藥相似。

2.2.3 光照

光照對原料藥和醇質體中5-ALA相對含量的影響見圖5。

t/ha 避光

由圖5可知,t=72 h,避光和自然光照射下的原料藥中5-ALA相對含量為42.6%和30.5%,醇質體中5-ALA為56.7%和60.9%。在避光條件下,原料藥和醇質體5-ALA的相對含量下降速度均略低于對應的自然光條件下的下降速度,說明光線對5-ALA有一定影響;不管是在避光還是自然光照射下,醇質體中5-ALA相對含量降低速度均低于原料藥的下降速度,特別是在光照下,二者的差異更大,說明醇質體對光線具有較好的阻隔作用。

3 結 論

采用pH梯度-乙醇注入法制備高包封率醇質體,其具有熱敏性,介質pH、溫度和光線等因素均會影響5-ALA的穩定性,其規律為堿性條件下5-ALA更容易降解,溫度越高降解速度越快,光照對藥物的降解影響相對較小,5-ALA被醇質體包載后可降低介質pH、溫度和光線等因素的影響,提高其穩定性。