m6A RNA甲基化調節因子與前列腺癌預后的關系

劉虹汝，寧靜華，張鑫，趙嚴紅，屈潤，張鈺哲，2，3

（1.大理大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，云南 大理 671000；2.云南抗病原藥用植物篩選重點實驗室，云南 大理 671000；3.云南省昆蟲生物醫藥重點實驗室，云南 大理 671000）

前列腺癌是指發生在前列腺上皮的惡性腫瘤，在全球男性腫瘤統計報告中位居第2位，每年有超過120萬例新診斷病例，相關死亡人數超過35萬［1-5］。影響前列腺癌發病的風險因素包括年齡、遺傳、高脂飲食、種族、地區、宗教信仰等。迄今為止，前列腺癌的發病機制仍未完全闡明，全基因組DNA測序、mRNA測序、蛋白質組分析和前列腺特異性抗原篩查為前列腺癌分型及其病理學的遺傳基礎提供重要見解［6］。前列腺癌發病機制中表觀遺傳分子途徑是目前的研究熱點，研究認為，其表觀遺傳改變比遺傳改變發生得更早、更頻繁。全基因組關聯研究已確定超過170個與前列腺癌發病率相關的單核苷酸多態性位點，單核苷酸多態性不僅可檢測早發性和家族性前列腺癌，還可用于計算遺傳風險評分，從而進行靶向篩查。同時，有研究［7］表明，微RNA可通過降解RNA或抑制蛋白質翻譯來控制蛋白質表達，其將成為前列腺癌診斷、預后和治療選擇的有潛在價值的標志物，以及前列腺癌治療的潛在藥物。

N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）是真核細胞中最豐富的RNA修飾［8］，目前已在所有生物體的RNA中鑒定出150多種轉錄后修飾。廣泛的RNA堿基修飾統稱為表觀轉錄組，與翻譯控制、RNA剪接和許多癌癥類型有關。m6A甲基化由m6A甲基轉移酶（包括METTL14、METTL3、KIAA1429、RBM15、ZC3H13和WTAP）、m6A去甲基酶（包括FTO和ALKBH5）、能與甲基化結合位點結合的特殊基因（包括YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2和HNRNPC）共同參與調控，其參與RNA代謝的諸多方面，如mRNA前體剪接、3’末端加工、出核轉運、翻譯調節、mRNA降解和非編碼RNA加工等。m6A甲基化異常會導致腫瘤發生和發育遲緩等，并對基因表達、調控產生深遠的影響［9］。雖然近年來m6A已成為腫瘤研究的熱點，但m6A修飾在前列腺癌發生、發展中的分子機制仍未被深入探索。因此，本研究旨在探尋m6A RNA甲基化調節因子（以下簡稱m6A調節因子）在前列腺癌組織中的差異表達情況，并探討其與預后的關系。

1 材料與方法

1.1 數據下載和整理

從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫下載416例前列腺癌組織樣本和80例癌旁組織樣本（共496例）的相關RNA-seq 轉錄組數據和相關臨床病理數據，包括年齡、T分期（原發腫瘤）、N分期（淋巴結轉移）、生存時間、生存狀態。

1.2 m6A調節因子的篩選和比較

本研究使用的12個m6A調節因子包括5個m6A甲基轉移酶（METTL3、METTL14、WTAP、RBM15和ZC3H13），5個能與甲基化結合位點結合的特殊基因（YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2和HNRNPC），2個m6A去甲基酶（FTO和ALKBH5）。從TCGA數據庫中下載這些調節因子在前列腺癌組織和癌旁組織中的mRNA表達量，使用R軟件Pheatmap包以及Wilcoxon 秩和檢驗，比較前列腺癌組織和癌旁組織中12個m6A調節因子的表達水平。

1.3 前列腺癌樣本的無監督聚類分析

使用R軟件Consensus Cluster Plus包和χ2檢驗，對前列腺癌組織進行無監督聚類分組，確定前列腺癌樣本分層聚類分析的最佳樣本組數，繪制Kaplan-Meier生存曲線，分析各組間的預后差異，探究m6A調節因子與前列腺癌預后的潛在關聯。

1.4 構建m6A調節因子的多因素Cox回歸模型及繪制生存曲線

通過R軟件對m6A調節因子進行多因素Cox回歸分析，篩選出差異表達的m6A調節因子，應用survival包繪制高風險組和低風險組的Kaplan-Meier生存曲線，評估高風險和低風險對前列腺癌患者總生存率（overall survival，OS）的影響。

1.5 臨床病理因素的風險評分和多因素Cox回歸模型

對臨床病理因素（包括年齡、T分期、N分期）進行風險評分，通過R軟件survival包對臨床病理因素和總風險評分進行多因素 Cox 回歸分析，繪制森林圖，判斷臨床病理因素和總風險評分能否作為獨立的預后指標。

1.6 列線圖分析

使用 library（rms）函數包進行由年齡、分期和風險評分組成的列線圖分析，用于預測患者2年、3年和5年的OS。

1.7 免疫組織化學染色

采用免疫組織化學染色，檢測包含前列腺癌組織樣本（n=20）和癌旁組織樣本（n=20）的組織芯片中METTL14和FTO蛋白表達水平。組織芯片經脫蠟、水化后，采用枸櫞酸緩沖液高壓修復抗原，冷卻至常溫。再用3% H2O2處理，避光封閉15 min；PBS洗滌3次，每次5 min；滴加山羊血清，37 ℃封閉30 min；4 ℃過夜，孵育兔抗人METTL14（EPR27234-62，中國Abcam公司）和FTO（ab94482，中國Abcam公司）單克隆抗體，稀釋濃度為1 ∶100；PBS洗滌3次，每次5 min，滴加兔通用IgG二抗，37 ℃孵育30 min；PBS洗滌3次，滴加辣根過氧化酶標記的三抗，37 ℃孵育30 min；PBS洗滌3次后，DAB顯色；流水沖洗15 min，蘇木精復染1 min后，流水沖洗30 min，脫水封片，在光學顯微鏡下觀察并采集圖像。采用半定量方法評價METTL14和FTO蛋白表達情況。METTL14和FTO蛋白染色強度：陰性，0分；弱陽性，1分；中陽性，2分；強陽性，3分。METTL14和FTO蛋白陽性染色百分比：＜5%，0分；5%～＜25%，1分；25%～＜50%，2分；50%～＜75%，3分；≥75%，4分。每個組織標本METTL14和FTO蛋白的染色積分為強度得分×百分比得分，總分為0～12分，其中＜9分為低表達，≥9分為高表達。

2 結果

2.1 數據下載和m6A調節因子的篩選與比較

本研究的496例前列腺癌患者中，年齡＜45歲223例，≥45歲273例；T分期：T2187例，T3291例，T411例；N分期：N0343例，N180 例；生存時間：＞5年84例，≤5年412例；生存狀態：死亡9例，存活487例。

416例癌組織樣本和80例癌旁組織樣本的m6A調節因子的差異表達分析結果顯示，8個m6A調節因子的表達水平有統計學差異（P＜0.05）。其中ALKBH5、FTO、METTL14、YTHDC1和ZC3H13在癌組織中下調，HNRNPC、METTL3和YTHDF1在癌組織中上調（圖1A）。比較12個m6A調節因子在不同T分期癌組織中的表達水平，結果顯示，不同分期時HNRNPC、YTHDC2、YTHDF1和YTHDF2的表達水平有統計學差異（P＜0.05），其中HNRNPC的表達量隨前列腺癌的進展出現顯著持續升高（圖1B）。將前列腺癌樣本按淋巴結轉移分為轉移組（N1）和無轉移組（N0），分析2組間12個m6A調節因子的表達差異。結果發現，N1組HNRNPC、RBM15、YTHDF1和YTHDF2mRNA的表達水平明顯高于N0組（圖1C）。上述結果表明，m6A調節因子與前列腺癌的發生和進展存在潛在關聯，對前列腺癌預后標志物的篩選具有研究價值。

圖1 前列腺癌樣本中 m6A 調節因子的表達情況Fig.1 Expression of m6A regulators in prostate cancer samples

2.2 前列腺癌樣本無監督聚類分析

根據8個差異表達的m6A調節因子的mRNA表達水平對前列腺癌樣本進行無監督聚類分析，確定最佳樣本聚類數為3（圖2A）。采用層次聚類方法將前列腺癌樣本分為3組，分別為Cluster 1、Cluster 2、Cluster 3（圖2B）。Kaplan-Meier生存分析結果顯示，3組間OS的差異有統計學意義（P＜0.05），Cluster 2的10年OS較Cluster 1和Cluster 3高，表明Cluster 2有較好的預后（圖2C）。以上結果表明，m6A調節因子對前列腺癌聚類結果與前列腺癌預后存在潛在關聯。

圖2 前列腺癌樣本的聚類和預后分析Fig.2 Clustering and prognostic analysis of prostate cancer samples

2.3 構建m6A調節因子的多因素Cox回歸模型及繪制生存曲線

構建多因素Cox比例風險模型，進一步篩選出與前列腺癌OS相關的m6A調節因子，其中METTL14和FTO的差異有統計學意義（P＜0.05）。根據風險評分的HR和95%CI，確定METTL14為前列腺癌獨立高風險影響因素（圖3A）。根據中位風險評分將樣本分為高風險組和低風險組，與低風險組相比，高風險組前列腺癌患者OS較低，差異有統計學意義（P＜0.05，圖3B）。

圖3 m6A調節因子與前列腺癌預后的關聯Fig.3 Association between m6A regulators and prostate cancer prognosis

2.4 風險評分與臨床病理因素的關系及多因素Cox回歸模型

對不同前列腺癌患者的臨床病理因素（包括年齡、T分期和N分期）進行風險評分，結果顯示，前列腺癌風險與臨床病理因素無關（圖4A～4C）。通過構建多因素Cox回歸模型對前列腺癌患者的風險評分、年齡、T分期和N分期進行分析，結果顯示，風險評分可作為前列腺癌的獨立預后指標（P＜0.05，圖4 D）。

圖4 風險評分與前列腺癌臨床病理因素的關系Fig.4 Association of risk score with clinicopathological factors in prostate cancer samples

2.5 列線圖的構建和驗證

通過多變量Cox回歸分析中包含的重要因素，即年齡、T分期、N分期和風險評分，發現列線圖構建的模型能夠較好地預測患者2、3和5年的OS（圖5）。

圖5 年齡、分期和風險評分組成的列線圖預測前列腺癌患者2年、3年和5年的OSFig.5 A nomogram of age，stage，and risk score predicts 2-，3-，and 5-year OS for prostate cancer patients.

2.6 免疫組織化學結果判斷

每張切片由2名病理科醫師進行獨立判斷并評分，兩者不一致時采取重新評估原則。每張玻片在高倍鏡視野下進行多處觀察，同一范圍采100個細胞。結果顯示，包含前列腺癌組織樣本和癌旁組織樣本的組織芯片中，METTL14和FTO蛋白陽性標記為棕黃色染色顆粒并彌漫分布于細胞核，前列腺癌組織與癌旁正常組織均表達METTL14和FTO。前列腺癌組織和癌旁正常組織中FTO蛋白陽性表達率分別為76%（76/100）和28%（28/100），染色積分分別為12分（高表達）和4分（低表達）；METTL14蛋白陽性表達率分別為54%（54/100）和11%（11/100），染色積分分別為9分（高表達）和2分（低表達）。鄰近正常組織中FTO和METTL14蛋白陽性表達率均明顯低于前列腺癌組織（均P＜0.05）。見圖6。

圖6 前列腺癌組織和癌旁正常組織中FTO和METTL14蛋白的表達Fig.6 Expression of FTO and METTL14 protein in prostate cancer tissues and adjacent normal tissues

3 討論

在人類基因組表觀遺傳學修飾中，已發現超過7 000多種mRNA和300多種非編碼RNA中存在m6A表觀遺傳學修飾［10］，并且越來越多的證據表明m6A這種高豐度修飾在腫瘤的發生和轉移中均有重要作用［11］。目前，對于前列腺癌轉移機制的研究和治療尚未取得突破性進展，迫切需要確定前列腺癌治療的新靶點，進而為前列腺癌的早期診斷和預后提供科學依據。因此，在前列腺癌中鑒定m6A甲基化調控基因可能提供有價值的治療新靶點。

本研究從TCGA數據庫下載了年齡、T分期、N分期等數據完整的496例樣本的臨床病理資料及mRNA相關數據，獲取了METTL3、METTL14、WTAP、RBM15、ZC3H13、YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2、HNRNPC、FTO和ALKBH5共12種m6A調節因子，篩選出5個下調（ALKBH5、FTO、METTL14、YTHDC1和ZC3H13）和3個上調（HNRNPC、METTL3和YTHDF1）調節因子；不同T分期的前列腺癌中HNRNPC、YTHDC2、YTHDF1和YTHDF2mRNA的表達水平不同，并且HNRNPC的表達量隨著前列腺癌的進展出現顯著持續升高；淋巴結轉移組RBM15、HNRNPC、YTHDF2和YTHDF1mRNA的表達水平明顯高于淋巴結未轉移組。對8個差異表達的m6A調節因子進行無監督聚類分析，將樣本分成Cluster 1、Cluster 2和Cluster 3，并且發現3組間OS存在統計學差異。多因素Cox回歸分析發現，m6A調節因子METTL14和FTO與前列腺癌患者的預后密切相關。構建LASSO回歸模型對前列腺癌患者進行風險評分，并分為高、低風險組，發現2組間OS有統計學差異，且風險評分可作為獨立預后指標，用于預測患者的生存情況。前列腺癌組織樣本和癌旁正常組織樣本的免疫組織化學染色結果顯示，METTL14和FTO蛋白水平在前列腺癌組織中高表達。值得注意的是，由于前列腺患者的死亡率低，且臨床數據中T4分期的樣本過少，導致根據T分期預測患者的生存情況結果欠準確，但這并不影響列線圖預測整體的準確性。未來可以通過擴大樣本量，進一步提高T分期在預測中的準確性。

研究發現，m6A甲基化結合位點結合的特殊基因中的HNRNPC可參與RNA的剪接、非特異性RNA輸出、RNA表達、3’末端加工和翻譯，并在黑色素瘤、肝癌、肺癌、膠質母細胞瘤等多種腫瘤中表達上調。研究［12］表明，沉默HNRNPC可減少膠質母細胞瘤細胞增殖并增強依托泊苷誘導的細胞凋亡，表明HNRNPC可作為膠質母細胞瘤預后和治療的潛在標志物。研究［13］指出，過表達HNRNPC時可促進化學抗性，通過小干擾RNA敲低HNRNPC可逆轉化學抗性，HNRNPC過表達與接受化療藥物治療的胃癌患者的生存率呈負相關，這表明HNRNPC與胃癌預后不良有關。研究［14］發現，HNRNPC過表達可通過上皮-間質轉化促使口腔鱗狀細胞發生癌變。本研究發現，HNRNPC的表達水平與前列腺T分期相關，HNRNPC的表達隨著前列腺癌的進展而顯著持續升高。從而推測，HNRNPC可能為前列腺癌提供新的治療靶點。

METTL14是m6A甲基轉移酶復合物的重要組成成分，在體外甲基化轉移能力較高，且在多種腫瘤中表達異常，參與多種腫瘤的惡性表型調控。FTO是第1個發現的m6A去甲基化酶，可以影響相鄰基因轉錄，消除mRNA的m6A修飾。FTO在急性髓系白血病、膠質母細胞瘤干細胞自我更新、宮頸鱗狀細胞癌化療、放療耐藥性中起關鍵作用。此外，FTO高表達促進胃癌細胞遷移、侵襲和淋巴結轉移，與不良預后密切相關。METTL14和FTO盡管已經被證明與多種癌癥的發展有關，但其在前列腺中的作用目前仍然不明確，且m6A調節因子在前列腺癌中的作用機制相關研究較少。

綜上所述，本研究發現，METTL14和FTO可成為獨立預測前列腺癌患者預后的關鍵調控基因，強調了RNA修飾在前列腺癌發生、發展中的重要作用，并為治療方法的選擇提供了潛在的標志物。