銅穩態失衡相關疾病及銅死亡的研究進展

張萌，石萌，劉寶琴

（1.中國醫科大學生命科學學院生物化學與分子生物學教研室，沈陽 110122；2.天津市腫瘤醫院空港醫院檢驗科，國家惡性腫瘤臨床醫學研究中心，天津 300308）

銅是生物體不可缺少的金屬元素，對人體生物化學起關鍵作用。健康成人銅攝取量0.9 mg/d，主要經氨基酸轉運蛋白在小腸內吸收，其吸收率約40%。組織中銅濃度為1～10 mg/g，血漿中銅濃度為1 000 ng/mL［1］。銅作為電子供體或者受體參與線粒體呼吸、神經遞質的生物轉化和結締組織成熟過程。另外，銅還有其他生物學功能，包括胚胎發育、對血紅蛋白水平的調控以及對肝細胞與神經元的調控功能等。體內銅有Cu+與Cu2+2種狀態。體液中銅主要以Cu2+存在，細胞內主要以Cu+存在。在氧化還原酶作用下Cu+與Cu2+之間發生轉換。銅特殊的電子結構使它作為氧化還原反應中酶的輔助因子參與并調控生物許多生命活動過程。

銅穩態是指機體對銅的吸收、分配、使用全過程處于動態平衡狀態。盡管機體需要有足量銅來維持生長和發育，但銅過度積累會在機體內造成潛在的氧化損傷，或者會與生物大分子發生非正常結合［2］。銅轉運系統在維持機體內銅穩態，確保組織正常功能方面起著關鍵性的作用。銅離子不足與過多均有危害，銅穩態失衡可能會導致各種疾病，并且與腫瘤的發生發展有關。銅死亡是銅依賴性受控細胞死亡方式，是一種新型細胞死亡方式。本文就銅轉運系統、銅穩態失衡相關疾病與銅死亡進行綜述，旨在為銅相關疾病的防治提供理論依據。

1 銅轉運系統

在多細胞生物體內，銅代謝包括吸收、分配、隔離和排泄。哺乳動物腸上皮細胞通過銅轉運蛋白（copper transporter，Ctr）1從食物中攝取銅離子。攝入后，銅離子被輸送到銅轉運P型ATP酶（ATP7A），ATP7A將腸細胞中的銅離子泵入血液。血液中銅離子經門靜脈入肝，再通過Ctr1進入肝細胞［3］。在肝細胞中，如圖1所示，銅可通過膽管分泌，或經銅伴侶蛋白antioxidant 1（Atox1）和銅轉運P型ATP酶（ATP7B）轉運、跨高爾基體網絡轉運后與銅藍蛋白（ceruloplasmin，Cp）結合釋放到血液中。銅主要儲存在線粒體中，細胞色素氧化酶17銅載體蛋白（cytochrome coxidase 17，COX17）和Sco細胞色素氧化酶缺陷同源物1/2（Sco 1/2）結合作用于呼吸鏈復合體IV。過量銅也可以與金屬硫蛋白（metallothionein，MT）結合。另外，銅也通過超氧化物歧化酶的銅伴侶蛋白（Cu chaperone for SOD，CCS）以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）1途徑參與氧化應激調控。釋放到血液中的銅通過與Cp、氨基酸或白蛋白結合來運輸，通過相應的調節機制來維持銅動態平衡［4］。

圖1 細胞內銅轉運Fig.1 Intracellular copper transport

銅轉運系統中，Ctr家族、銅轉運P型ATP酶、銅伴侶蛋白對于銅的攝取與轉運以及維持細胞內銅穩態都起著至關重要的作用。

1.1 Ctr家族

Ctr家族（Ctr1～5）是真核細胞特異介導的銅吸收結構。Ctr1蛋白的結構M-XM2或M-X2-M，是細胞內進行代謝的前提條件和基礎功能結構。Ctr2與Ctr1高度同源，編碼低結合力轉運蛋白。Ctr3是與Ctr1有關的銅缺失抑制物，其轉運Cu2+的能力較強。Ctr4和Ctr5具有完整的膜蛋白結構，受銅水平和銅敏感因子共同調控［5］。Ctr1、Ctr3對銅吸收調節的高親和力位點幾乎在動物各組織中均有分布，且以肝臟及腎臟表達最多。Ctr1是細胞膜上的跨膜轉運蛋白，Ctr1的C端在胞內，N端在胞外。Ctr1蛋白多以同型三聚體形式致密地排列于膜表面，與孔狀結構相似，利于銅進入細胞［6］。Ctr1蛋白作為銅從細胞外向胞內轉移的主要傳送蛋白之一，其表達直接影響著體內銅代謝是否處于平衡狀態，同時Ctr1蛋白還是銅吸收、轉運以及促進生長等過程中的關鍵［7-8］。Ctr1蛋白表達受到體內Cu2+水平的調節，當體內Cu2+水平下降時會促進Ctr1蛋白表達，否則會抑制Ctr1蛋白表達。Ctr1對Cu2+的轉運需要能量，受到細胞內H+濃度和細胞外K+濃度的影響。因此，細胞中仍然有其他物質能夠利用Cu2+信號來調節Ctr1基因轉錄［9］。另有研究［10］顯示，Ctr1翻譯之后可能會通過負調控來調控細胞中Cu2+水平，通過提高Cu2+水平加速細胞膜上Ctr1蛋白的內吞與降解，從而調控銅吸收，避免銅超載。

當前已有研究表明哺乳動物體內至少有1條異于Ctr1蛋白所介導的銅轉運途徑。有研究［11］報道，敲除小鼠腸上皮細胞內Ctr1基因后發現8～10團高度聚集的銅，銅依賴性酶嚴重缺乏但CCS明顯升高。細胞中高度聚集的銅不一定是通過Ctr1蛋白介導的銅轉運進入細胞膜。另有研究［5］報道，銅含量缺乏的小鼠體內僅有一些特定組織（腦組織、脾臟等）發現了Ctr1蛋白，提示Ctr1蛋白介導Cu2+的轉運具有組織特異性，而其他組織則可能有異于Ctr1蛋白的轉運機制來介導銅的轉運。

1.2 銅轉運P型ATP酶

銅轉運P型ATP酶有ATP7A和ATP7B 2個亞型，二者同源性較高，對細胞排泄Cu2+起關鍵性作用。ATP7A在小腸的表達較多，除了肝臟外，腦、腎臟及肌肉等部位均有少量表達。ATP7B表達以肝臟為主，腦、腎臟及胎盤等部位有少量表達。ATP7A和ATP7B主要分布在細胞內高爾基體上，C端存在6種Cu2+結合部位，每個結合部位可以與1個Cu2+結合進行銅的轉運。ATP7A和ATP7B具有8種Tm跨膜區以及1種ATP結合部位［12］。N端可以和膜分子上63條氨基酸片段相結合，促進膜中囊小泡轉運酶參與對銅的轉運。銅轉運P型ATP酶在體內主要與銅排泄有關，ATP7A、ATP7B共同催化ATP分解和供能，并促進銅排泄。

已有研究［13］報道，細胞內Cu2+水平正常時ATP7A更多是通過高爾基轉運系統內銅分泌途徑進行銅轉運；而在細胞內銅水平升高時，ATP7A脫離高爾基體轉運到細胞膜上并泵送Cu2+?？梢夾TP7A具有特異性銅結合位點，銅水平的改變對ATP7A轉運產生影響。ATP7B基因缺陷后肝細胞無法轉運銅至高爾基體中合成Cp，隨著膽汁分泌而排出體外，或者大量銅進入血中沉積于肝和腦、腎和角膜等肝外組織，發生銅中毒而導致神經系統損傷［14］。

1.3 銅伴侶蛋白

目前，已知細胞內主要的銅伴侶蛋白有Atox1、COX17和CCS。Atox1的結構為Met-X-Cys-X-X-Cys，結合并運載Cu2+至分泌部位。COX17是富含半胱氨酸的蛋白質，可結合1～4個Cu2+，為線粒體細胞色素氧化酶提供Cu2+。CCS能夠將銅傳遞給Cu-ZnSOD。Ctr1蛋白在Cu2+轉移到細胞后，隨即與細胞中對應的銅伴侶蛋白融合、轉運、組裝到細胞中的不同靶蛋白上，協同發揮機體的多種生理功能。銅伴侶蛋白與Cu2+結合后輔助和轉運到對應靶蛋白中發揮銅轉運功能。銅伴侶蛋白能特異性地將銅轉運至特定地點，在銅轉運中必不可少；而且3種銅伴侶蛋白轉運與調控方式均不相同。

1.3.1 Atox1：主要分布于細胞質，Atox1將Cu2+向高爾基體上的ATP7A/B轉運，再向Cp、賴氨酸酰氧化酶等銅依賴性蛋白酶（lysyloxidase，LOX）轉運，介導胞內過多銅離子向外釋放［15］。有研究［16］報告敲除Atox1基因后細胞呈現Cu2+積累現象，表明Atox1在細胞內銅轉運過程中發揮作用。

1.3.2 COX17：最早研究［17］發現真菌中COX17具有細胞色素氧化酶作用，此后研究［18］發現哺乳動物中COX17具有活化細胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase，CCO）和促進胚胎發育等作用。COX17接收從Ctr1蛋白轉運來的Cu2+，再將Cu2+轉運至線粒體，然后再轉移至線粒體Sco1/2中，最后Cu2+組裝成具有活性的CCO來發揮生物學作用［19］。

1.3.3 CCS：CCS在哺乳動物細胞和酵母細胞內為SOD1提供Cu2+。已有研究［19］報道敲除CCS基因小鼠體內SOD1活性下降，SOD1敏感性升高，明確CCS是SOD1獲得Cu2+的主要方式。

另外，銅伴侶蛋白的轉運及調控中，可能還有其他銅伴侶蛋白一方面對細胞剩余游離銅毒性發揮屏蔽作用，另一方面也是特異性銅運輸的載體，輔助組裝到多種靶蛋白上，裝配成活性蛋白而發揮作用。細胞中同時有許多銅伴侶蛋白，這些伴侶蛋白不是孤立存在，而是在體內互相協同轉運發揮生物學功能。

總之，胞外Cu2+內流主要依靠高親和力轉運蛋白Ctr1，銅的利用途徑包括Atox1-ATP7A/B-Cp途徑、COX17-Sco1/2-CCO途徑和CCS-SOD1途徑。哺乳動物腸細胞和肝細胞中ATP7A和ATP7B將Cu2+泵入血液或膽汁中，由基底膜從腸細胞泵入血液的Cu2+可以轉運到全身，而由ATP7B介導釋放到膽汁中的Cu2+排出體外。銅通過這些途徑進行轉運，銅伴侶蛋白是可溶性胞質蛋白，它與Cu2+結合并將Cu2+運送到目標蛋白，即細胞通過蛋白質協調來保護自身不受Cu2+的傷害。

2 銅穩態失衡相關疾病

2.1 銅缺乏

門克斯病是伴有X隱性遺傳性疾病的罕見疾病，因ATP7A突變使銅無法由腸上皮細胞入血，妨礙大部分組織對銅的吸收與分配，從而造成機體銅的缺乏［20］。銅缺乏時首要臨床表現為貧血、進一步銅缺乏可累及結締組織缺陷甚至降低骨密度，銅缺乏癥后期除全血細胞降低外還可出現嚴重精神癥狀［21］。門克斯病患者因銅轉移到腦內減少而出現嚴重精神及發育障礙，一定程度上是由于銅依賴性酶活性下降所致。其臨床表現除重度進行性神經變性外，還有結締組織異常、肌張力下降、皮膚頭發色素沉著減退等。

線粒體功能受損是造成門克斯病患者大腦嚴重損傷的重要原因。研究［22］發現，門克斯病患者CCO活性缺乏、腦內乳酸水平增高和N-乙酰天冬氨酸水平下降。這些產物與神經元線粒體能量的產生相關聯，其水平變化可以作為線粒體氧化磷酸化失敗的標志。

門克斯病治療主要是腸內注入銅組氨酸，而且至少應在新生兒剛出生不久即開始治療［23］。具有剩余ATP7A活性的門克斯病新生兒對這種治療更敏感，因此，恢復低水平ATP7A的基因治療可能成為一種替代的治療方案。

2.2 銅過量

肝豆狀核變性疾病又稱為威爾遜病，是主要發生于青少年的常染色體隱性遺傳疾病，常伴有肝臟、眼和神經等癥狀，是銅運輸ATP7B遺傳缺陷所致。因ATP7B功能受損，銅無法由肝細胞分泌至膽汁而蓄積于肝臟等組織，引起惡性、嘔吐及腹瀉等腸胃道癥狀，導致慢性銅中毒。約半數威爾遜病患者出現中樞神經系統毒性表現，同時可影響神經節與腦協調活動部位而出現運動障礙［21，24-26］?；颊咭话惝a生不正常星形膠質細胞（阿爾茲海默?、裥秃廷蛐图毎?，這可作為威爾遜病神經病理的典型特征。

威爾遜病治療通常是限制飲食中銅的吸收；通過螯合治療或肝移植來延長生存時間。研究［24，27］認為，有或無神經系統癥狀的肝功能不全或肝炎患者應使用銅絡合劑D-青霉胺、曲安汀或四硫代鉬酸鹽（TM）或鋅治療。D-青霉胺作為還原性螯合劑可減少銅與蛋白質之間的親和作用，從而更加高效地螯合銅，但是青霉胺還具有嚴重不良反應，可引起血液學或者腎臟毒性等。因此對無癥狀患者可采用鋅處理。鋅因誘導腸道MT合成導致體內銅水平下降，MT蛋白與銅親和力強而形成銅-蛋白復合物，銅-蛋白復合物不吸收從糞便中排泄，因此，鋅已成為威爾遜病維持治療的首選藥物［21］。

2.3 腫瘤

銅參與腫瘤發生發展過程中的一系列生物學行為（腫瘤細胞的無限分裂，血管的生成與轉移等等）［28-29］。近年來研究［30-32］發現腫瘤組織及腫瘤患者血清中Cu2+水平較正常組織明顯偏高?？梢娂毎麅菴u2+水平與腫瘤發生、發展密切相關。研究顯示，一方面Cu2+可直接與血管生成因子結合，促使腫瘤組織血管生成［33］；另一方面，Cu2+可活化腫瘤細胞中與增殖、代謝有關的蛋白酶，從而影響腫瘤細胞的侵襲和轉移［34-35］。臨床研究［36］顯示癌變組織及患者血清中Cu2+含量顯著增加，鐵、鋅等其他金屬離子含量顯著減少。

調控細胞內Cu2+濃度及轉運途徑在癌細胞增殖及轉運過程中起著至關重要的作用，體內Cu2+含量減少使COX1活性、ATP含量下降，氧化磷酸化程度下降，進而抑制癌細胞增殖。Cu2+水平下降可以抑制細胞內上皮細胞-間質轉化［37］。上皮細胞-間質轉化是細胞釋放極性和細胞間黏附而獲得遷移和侵入的過程，但此結果是否在癌癥患者體內發生尚不明確［37］。

研究［38］證明，抑制銅轉運蛋白Atox1盒CCS可以顯著抑制癌細胞增殖，而且不影響正常細胞；進行靶向Cu2+調控及轉運通路的藥物研究可能是抗腫瘤藥物開發的一種新策略。治療銅過量的經典藥物為銅螯合劑四硫代鉬酸鹽，它能迅速螯合耗用銅而成為高效抗血管生成劑。四硫代鉬酸鹽具有雙重作用，向食品中添加四硫代鉬酸鹽，可使銅及食品中蛋白組成三方復合物以阻止銅吸收［20，39］。另有研究［40］報道COX17也能使抗腫瘤藥物順鉑轉移到線粒體內，進而促進細胞凋亡。另外，腫瘤組織中Cu2+水平高，應考慮抗癌藥物與銅的相互作用［41］。

3 銅死亡

多細胞生物在發育過程中，存在著多種預定的、精確控制下的細胞程序性死亡（細胞凋亡、程序性壞死、細胞焦亡以及鐵死亡等）［42］。其中，鐵死亡是2012年發現的一種鐵依賴性的新型細胞程序性死亡方式［43］。鐵死亡由過度堆積的過氧化脂質誘導發生，其形態特征、作用方式以及分子機制與其他程序性死亡方式截然不同。銅死亡是2022年3月發現的銅依賴性受控細胞死亡方式。研究［44］證實，當阻斷已知的細胞死亡方式，銅離子仍然可以誘導細胞死亡。研究［44］進一步揭示了銅死亡的機制，是通過銅離子與線粒體呼吸的三羧酸循環中的脂?；煞种苯咏Y合而發生的，導致脂?；鞍踪|聚集和隨后的鐵硫蛋白簇蛋白下調，從而導致蛋白質毒性應激并最終導致細胞死亡。研究［44］還確定了肝細胞和神經元更容易受到銅死亡的影響，這些發現有助于人們研究銅失調疾病，可為腫瘤治療提供了新的思路。

4 總結與展望

銅是人體不可忽視的微量元素，銅穩態對于維持生命體正常功能至關重要。銅穩態失衡可引起許多生理功能改變和疾病的發生。因此，未來有望通過調節細胞內銅的含量來治療與銅相關的疾病。（1）螯合劑治療：使用特定的螯合劑來結合和清除體內過量的游離銅離子。這些螯合劑能夠結合銅并促使其排出體外，從而降低細胞內銅的含量。（2）銅代謝調控藥物：開發藥物來干預體內銅代謝的不正常過程。這包括促進銅的吸收、分配或排泄，以恢復正常的銅平衡。（3）基因治療：在某些遺傳性銅代謝疾病中，可能使用基因治療方法來修復或替代缺陷基因，以恢復正常的銅代謝。（4）蛋白質調控：通過改變銅相關蛋白質的表達或功能，可以調節細胞內銅的含量。這可能包括增加或減少銅運輸蛋白的表達，以控制銅的吸收和分配。（5）定向療法：針對特定疾病或情境，開發針對性的治療方法。例如，對威爾遜病，可以使用針對ATP7B蛋白的藥物來減少銅在肝臟中的積累。這些方法的開發和應用需要深入的研究，以確保它們的有效性和安全性。治療銅相關疾病是一個復雜的領域，隨著對銅代謝和銅相關疾病的深入了解，我們有望在未來提供更有效的治療方法。