納米銀脅迫下土壤微生物磷脂脂肪酸的響應特征

宋宇迪，樊昊心，姚槐應

武漢工程大學環境生態與生物工程學院，湖北 武漢 430205

納米銀（silver nanoparticles，AgNPs）是指在三維空間中至少有一維的尺寸范圍在納米級別（1～100 nm）的金屬銀單質［1］。AgNPs 是應用最廣泛的工程納米材料之一。據估計，AgNPs 相關產品的全球產量約為每年450 t［2］，其市場規模預計將從2014 年的7.9 億美元增長到2022 年的25.4 億美元［3］。AgNPs 與傳統銀單質相比，具有更為高效的抗菌性能［4］和獨特的物理化學性質（催化活性、有效導電性、特定光學性質等），因而廣泛應用于醫療［5］、環保［6］、食品［7］、工業生產［8］等領域。此外，AgNPs 在農業生產方面有著廣闊的應用前景，可以用于促進植物生長和管理植物病害［9］等。AgNPs 的生產和消費規模日益增加，繼而通過各種途徑在自然環境中釋放和積累［10］，因此產生潛在的生態風險。根據建模結果，納米材料在土壤中的排放量高于在水體和大氣中的排放量［11-12］。將含有AgNPs 的污泥等生物固體用作農業肥料、使用污水灌溉農田、不當處理醫療和消費品廢棄物［13-14］等，會造成AgNPs 在土壤中，尤其是農田土壤的積累。

微生物是土壤中最為豐富多樣的生物種群，在維持生態平衡、驅動生物地球化學循環等方面起著重要作用［15］。微生物群落的變化可以反映土壤污染物的生態脅迫效應［16-17］。環境中的AgNPs會不同程度地改變微生物活性和群落結構。Peixoto 等［18］研究了AgNPs 長期暴露對土壤細菌群落的影響，發現暴露56 d 后細菌群落結構與對照組相比僅有71.9%的相似性。Montes 等［19］發現AgNPs 在預測環境質量分數下使土壤微生物生物量有所下降。Samarajeewa 等［20］通過一系列微生物測試評估了沙壤土中聚乙烯吡咯烷酮包被的AgNPs（3～706 mg·kg-1）對微生物生長、活性和多樣性的影響，結果表明AgNPs 對土壤微生物群落活性有顯著的抑制作用，而且毒性隨著時間的推移變得更加明顯。

磷脂是含有磷酸基團的脂質，是生物細胞膜的主要成分。不同微生物具有不同種類的磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA），其含量和結構具有種屬特征或與其分類密切相關，能夠標志某種或某類特定微生物的存在［21］。不同微生物群落具有獨特的PLFA 特征譜圖，因此PLFA 可以用于對微生物群落進行識別和定量描述，PLFA 的變化反映了環境樣品中微生物群落結構的變化［22］。此外，由于磷脂不能作為細胞的貯存物質，微生物細胞死亡后，其中的磷脂化合物會迅速降解，因而PLFA 可以代表微生物群落中的活性微生物［23］。使用PLFA 鑒定微生物種類并定量分析微生物群落生物量和群落結構，克服了傳統微生物培養及計數方法的缺點，具有較高的準確性、穩定性和敏感性［24］，被廣泛應用于土壤微生物群落研究［25］。

目前，關于不同水平AgNPs 脅迫下土壤微生物PLFA 變化的研究較少。因此，本研究以農田土壤為研究體系，對不同水平AgNPs 脅迫下土壤微生物PLFA 含量、豐度及群落結構的變化趨勢進行分析，探究土壤微生物PLFA 對AgNPs 脅迫的響應特征。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

1.1.1 主要試劑 納米銀粒子（上海麥克林生化科技股份有限公司，純度為99.5%，粒徑為60～120 nm）。使用的化學試劑主要包括：乙酸（分析純），氫氧化鉀（分析純），一水合檸檬酸（分析純），二水合檸檬酸三鈉（分析純），氯仿（色譜純），丙酮（色譜純），正己烷（色譜純），甲醇（色譜純），甲苯（色譜純）；以上試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 供試土壤 土壤采集自甘肅定西的旱地農田。采用對角線布點法采集3 個子樣，每個子樣點從上至下鏟取0～15 cm 表層土壤，充分混勻后采用四分法保留5 kg 土壤。使用孔徑為2 mm 的土壤篩清除土壤中的植物殘體和礫石，儲存在4 ℃下。實驗開始前，所有土壤樣品在25 ℃下避光預培養7 d，使土壤微生物從干擾中恢復活性。

土壤樣品具有以下特性：土壤總有機碳含量為4.70 g·kg-1，總氮含量為0.40 g·kg-1；土壤銨態氮含量為1.19 mg·kg-1，硝態氮含量為65.05 mg·kg-1；土壤pH 值（土水質量比為1.0∶2.5）為8.34；土壤質地為粉壤土，其中砂粒（0.02～2.00 mm）質量分數為28%，粉粒（0.002～0.020 mm）質量分數為68%，粘粒（＜0.002 mm）質量分數為4%。

1.2 方 法

1.2.1 實驗設計 本研究設計在土壤中添加10、100、1 000 mg·kg-1AgNPs（Ag10 組，Ag100 組，Ag1 000 組），并以未添加AgNPs 的土壤作為對照組（CK 組），共計4 種處理，每種處理設置3 個平行樣品。AgNPs 以粉末形式添加到土壤中；首先向空白土壤加入質量分數10 g·kg-1AgNPs，使用攪拌裝置持續混合10 min；然后采用10 倍稀釋法［26］，對含有10 g·kg-1AgNPs 的土壤進行“稀釋”，添加空白土壤使其依次達到目標質量分數，每次“稀釋”后使用攪拌裝置充分混合。建立微宇宙土壤培養體系，將10 g 含有目標質量分數AgNPs 的土壤放入培養瓶，置于生化培養箱（LRH-250，上海一恒科學儀器有限公司）中25 ℃下避光培養56 d。每隔2 d 向土壤中補充無菌去離子水，采用差量法使土壤水分維持在土壤持水量的60%。

1.2.2 微生物PLFA 的提取和檢測 將土壤樣品在-80 ℃下冷凍12 h，使用冷凍干燥機（FreeZone，美國Labconco 公司）凍干48 h。采用改良的Bligh-Dyer 法提取土壤微生物PLFA［27］，包括提取脂類、分離磷脂和甲醇酯化3 個步驟：（1）稱取1.00 g 凍干土壤樣品，加入7.6 mL 甲醇-氯仿-檸檬酸緩沖液（體積比2.0∶1.0∶0.8）進行萃取，50 r·min-1水平振蕩2 h，1 500 r·min-1離心10 min；重復萃取1次。將上清液與6 mL 氯仿和4.8 mL 檸檬酸緩沖液混合，靜置4 h，轉移下層有機相并使用氮吹儀（DC-24，上海安譜實驗科技股份有限公司）吹干。（2）加入5 mL 氯仿溶解氮吹后的樣品，并轉移到固相萃取柱中，依次加入8 mL 氯仿、10 mL 丙酮和8 mL甲醇洗脫中性脂、糖脂和磷脂，收集磷脂。再加入200 μL 99.36 μmol·L-1十九烷酸甲酯作為內標物質，使用氮吹儀吹干。（3）加入1 mL 甲醇甲苯混合溶液溶解氮吹后的樣品，并加入1.0 mL 0.2 mol·L-1氫氧化鉀甲醇溶液，37 ℃水浴15 min。加2.0 mL正己烷氯仿混合溶液、0.3 mL 1 mol·L-1乙酸溶液和2.0 mL 無 菌 去 離 子 水，50 r·min-1水 平 振 蕩10 min，以1 500 r·min-1速度離心10 min；重復提取1 次。轉移上層有機相并使用氮吹儀吹干。

加入正己烷溶解氮吹后的磷脂脂肪酸甲酯，使用MIDI 全自動微生物鑒定系統（Sherlock，美國MIDI 公司）和氣相色譜儀（7890B，美國安捷倫科技有限公司）檢測微生物PLFA。系統根據各組分的出峰時間和保留時間，與系統譜庫中的標準數值相匹配，鑒定PLFA 的種類。PLFA 常見命名格式包括X：YωZ（c/t）、（i/a）X：0、X：0 cy、X：0 10Me等。其中，X表示碳原子數；Y表示雙鍵數；ω 表示甲基末端；Z表示雙鍵到甲基端的距離；c/t分別表示順式和反式；i/a分別表示異構和反異構支鏈；cy表示環丙烷脂肪酸；Me 表示甲基［28］。

1.3 數據處理

1.3.1 微生物PLFA 含量和多樣性的計算 微生物PLFA 含量采用峰面積歸一化法計算：

其中Ai為第i種特征PLFA 的峰面積值，ms為內標物質的物質量，As為內標物質的峰面積值，m為土壤樣品干重。

微生物PLFA 的Shannon 多樣性指數（H）、Pielou 均勻度指數（J）和Simpson 優勢度指數（D）計算公式［29］如下：

其中Pi為第i種特征PLFA 占總PLFA 的比例；S為微生物群落中PLFA 的頻次。

1.3.2 統計分析 所有數據使用IBM SPSS Statistics 25 進行統計分析，并使用Origin 2021 進行繪圖。采用單因素方差分析，在p＜0.050 水平上進行最小顯著性差異分析（least significant difference，LSD）?；赟pearman 相關系數分析AgNPs 質量分數與微生物PLFA 之間的相關性。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）反映基于PLFA 的微生物群落結構變化。采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗和Wilcoxon 秩和檢驗檢測PLFA 豐度差異，并進行線性判別分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）。

2 結果與討論

2.1 微生物PLFA 的種類

通過系統鑒定和計算，識別并篩選出相對含量大于1%的原核生物PLFA 共23 種（見表1）。其中細菌PLFA 共12 種，包括6 種革蘭氏陽性菌（gram-positive bacteria，G+）PLFA 和6 種革蘭氏陰性菌（gram-negative bacteria，G-）PLFA；真菌PLFA共2 種，包括1 種普通真菌PLFA 和1 種叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）PLFA；放線菌PLFA 共5 種；通用PLFA 共4 種。

表1 納米銀脅迫下土壤微生物PLFA 種類Tab.1 Species of soil microbial PLFAs under AgNPs stress

2.2 微生物PLFA 的含量

如圖1 所示，相關性分析表明，微生物PLFA含量與AgNPs 質量分數之間存在顯著負相關（p＜0.050）。如圖2 所 示，與對 照組相比，Ag10 組、Ag100 組和Ag1 000 組的微生物PLFA 總含量、真菌、放線菌及G-的PLFA 含量分別降低了11.2%～43.0%、14.4%～46.9%、8.6%～52.1%、14.9%～29.4%（p＜0.050）。此外，Ag10 組的細菌、G+及AMF 的PLFA 含量與對照組之間沒有顯著差異（p＞0.050），而Ag100 組 和Ag1 000 組 的 相 應 類 群PLFA 含 量 分 別 降 低 了25.9%～39.3%、40.4%～57.3%、33.1%～52.3%（p＜0.050）。

圖1 AgNPs 質量分數與土壤微生物PLFA 含量、豐度及比值、多樣性指數的Spearman 相關性Fig.1 Spearman correlation between AgNPs mass fraction and content，abundance，ratio，and diversity index of soil microbial PLFA

圖2 不同水平AgNPs 脅迫下土壤微生物PLFA 含量Fig.2 Content of soil microbial PLFAs under different levels of AgNPs stress

上述結果表明，AgNPs 對微生物整體及各主要類群的生物量存在明顯的劑量依賴性抑制作用。Xin 等［30］發現，經過2 個月的培養后，微生物生物量在200 和500 mg·kg-1AgNPs 暴露下均發生顯著減 少。Montes 等［19］發現，在暴露于0.015、0.150、1.500 μg·kg-1AgNPs 60 d 后，土壤中G+和放線菌生物量均有所下降。

2.3 微生物PLFA 的豐度及其比值

如圖1 所示，相關性分析表明，細菌和G-的PLFA 豐度與AgNPs 質量分數之間存在顯著正相關，放線菌、G+和AMF 的PLFA 豐度與AgNPs 質量分數之間存在顯著負相關，因此G+/G-豐度比值與AgNPs 質量分數之間存在顯著負相關（p＜0.050）；而真菌PLFA 豐度及真菌/細菌豐度比值與AgNPs 質量分數之間沒有顯著相關性（p＞0.050）。

如圖3 所示，與對照組相比，Ag10 組的真菌、細菌、G-和AMF 的PLFA 豐度沒有顯著差異（p＞0.050）；Ag100 組的真菌、細菌、G-的PLFA 豐度分別升高了13.4%、4.7%、15.9%（p＜0.050），而AMF的PLFA 豐度沒有顯著差異（p＞0.050）；Ag1 000組真菌和AMF 的PLFA 豐度則分別降低了7.2%、16.6%，而細菌和G-的PLFA 豐度分別升高了6.4%、23.7%（p＜0.050）。此外，Ag10 組放線菌和G+的PLFA 豐度分別升高了3.0%、9.4%，而Ag100組和Ag1 000 組的相應類群PLFA 豐度分別降低了16.2%～16.7%、15.9%～25.1%（p＜0.050）。

圖3 不同水平AgNPs 脅迫下土壤微生物PLFA 相對豐度Fig.3 Relative abundance of soil microbial PLFAs under different levels of AgNPs stress

如圖4 所示，與對照組相比，Ag10 組的G+/G-豐度比值升高了14.2%，而Ag100 組和Ag1 000 組降低了27.3%～39.4%（p＜0.050）。同時，Ag10 組和Ag100 組的真菌/細菌的豐度比值與對照組之間沒有顯著差異（p＞0.050），只有Ag1 000 組降低了12.8%（p＜0.050）。

圖4 不同水平AgNPs 脅迫下土壤微生物PLFA 相對豐度比值Fig.4 Ratios of soil microbal PLFA values under different levels of AgNPs stress

高質量分數AgNPs（100、1 000 mg·kg-1）暴露下，G-豐度顯著升高。Liu 等［31］發現，在1 mg·kg-1AgNPs 脅迫下，G-豐度增加，G+豐度減少。G-的耐受性可能歸因于其細胞外膜的脂多糖，在銀離子接觸細胞時提供了一定的保護作用［32］。此外，Montes 等［33］發現，暴露第60 d 時，與細菌相比，真菌對AgNPs 相對不敏感。這可能是由于真菌作為一種真核生物，對Ag+和重金屬更具耐受性。Kumar 等［34］發現在含0.066%AgNPs 的土壤中，細菌PLFA 減少，具有抗氧化特性的Hypocreales 真菌占比從1%增加到70%。

2.4 微生物PLFA 的多樣性

如圖1 所示，相關性分析表明，微生物PLFA的Shannon 指 數、Pielou 指 數 和Simpson 指 數 與AgNPs 質量分數之間均存在顯著負相關（p＜0.050）。如圖5 所示，與對照組相比，Ag10 組的多樣性指數沒有顯著差異（p＞0.050），Ag100 組和Ag1 000 組的Shannon 指數、Pielou 指數和Simpson指數分別降低了1.9%～3.2%、0.9%～1.4%、1.9%～3.2%（p＜0.050）。

圖5 不同水平AgNPs 脅迫下土壤微生物PLFA 多樣性指數Fig.5 Diversity indexes of soil microbal PLFA under different levels of AgNPs stress

如圖6 所示，PCA 坐標軸1 和軸2 對微生物群落結構的解釋率分別為76.9%和10.8%。對照組與Ag10 組之間的距離較為接近，表明低質量分數AgNPs（10 mg·kg-1）暴露引起的微生物群落組間差異較小。Ag100 組和Ag1 000 組與對照組在坐標軸1 上的距離較遠，且2 個處理組之間的距離較為接近，表明高質量分數AgNPs 引起微生物群落結構的顯著變化。

圖6 土壤微生物PLFA 的主成分分析Fig.6 Principal component analysis of soil microbial PLFA

隨著AgNPs 質量分數增加，微生物多樣性逐漸下降，群落組間差異逐漸增大。Zou 等［35］發現，高質量分數AgNPs 處理組的Chao1 指數和Shannon 指數低于對照組；即使在30 d 后，處理組多樣性指數仍然未恢復到對照組水平。這種長期影響可能是由于AgNPs 在土壤中的滯留和緩慢釋放，AgNPs 的毒性效應隨著時間推移而增強［36］。微生物群落結構的變化主要是由于物種豐度發生變化，不同微生物物種對AgNPs 的響應不同，銀抗性較強的物種豐度升高，對銀敏感的物種豐度下降。此外，群落結構的變化程度與AgNPs 質量分數密切相關。Vasileiadis 等［37］研究發現細菌16S和真菌ITS 基因拷貝數的平均EC50 為89.3 和202.0 mg·kg-1。

2.5 不同處理組間微生物PLFA 的差異

對土壤微生物PLFA 豐度進行LEfSe 分析。如圖7 所示，設定線性判別分析值＞3.8，p＜0.050，共發現8 種具有顯著差異的特征PLFA。在對照組中，放線菌標志脂肪酸16：0 10Me 被顯著富集；在Ag10 組中，G+標志脂肪酸a15：0 和i16：0及放線菌標志脂肪酸18：0 10Me 被顯著富集；在Ag100 組中，真菌標志脂肪酸18：2 ω6c 及放線菌標志脂肪酸18：1 ω7c 10Me 被顯著富集；在Ag1 000 組中，G-標志脂肪酸16：1 ω7c 和18：1 ω7c 被顯著富集。結果表明，不同質量分數AgNPs 能夠顯著改變土壤微生物群落結構。

圖7 微生物群落組間差異PLFA 的LEfSe 分析：（a）進化分支圖，（b）分布柱狀圖Fig.7 LEfSe analysis of PLFA for differences in microbial communities：（a）cladogram，（b）distribution bar chart

Zhang 等［38］發現，在未種植和種植黃瓜的土壤中，一些脂肪酸及其前體在AgNPs 暴露下顯著降低。PLFA 的變化可能是由于AgNPs 誘導生成了大量活性氧。Gunawan 等［39］發現AgNPs 破壞了磷脂酰乙醇胺中的磷酸胺和脂肪酸基團，并認為觀察到的細胞膜損傷至少部分是由AgNPs 在其浸出過程中產生的活性氧自由基所造成；細胞內膜磷脂上的包膜靶向可能會引起致死水平的細胞超氧化物和羥基自由基的快速生成。另外，微生物群落中的不同類群可能會對自身細胞膜上的PLFA 作出調整，以應對AgNPs 脅迫。

3 結 論

（1）不同水平AgNPs 脅迫下，土壤微生物PLFA 含量受到劑量依賴性的抑制作用；細菌和G-豐度受到一定的促進作用；G+/G-豐度比受到一定的抑制作用，真菌/細菌豐度比與AgNPs 質量分數沒有顯著相關性（p＞0.050）。

（2）不同水平AgNPs 脅迫下，土壤微生物PLFA 多樣性指數降低0.9%～3.2%（p＜0.050），微生物群落組間差異隨AgNPs 質量分數增加而增大。

（3）G+標志脂肪酸a15：0 和i16：0、真菌標志脂肪酸18：2 ω6c，以及G-標志脂肪酸16：1 ω7c 和18：1 ω7c 的豐度在不同質量分數AgNPs 處理組間具有顯著差異（p＜0.050）。

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