磷酸化EZH2 在頭頸部鱗癌中的表達特征及對化療敏感性的影響*

星博凡 王宇 劉超 周倩倩 張睿哲 徐芳泉 任玉 周旋

頭頸部腫瘤是全球第六大常見的惡性腫瘤，發生于口腔、鼻咽、口咽、下咽部、喉以及鼻組織。其中，頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是頭頸部惡性腫瘤最常見的病理類型。HNSCC 是一種侵襲性強、預后差的疾病[1]，60%以上的HNSCC 患者在確診時已經處于局部晚期或轉移階段。近年盡管在治療方式上取得了顯著的進步，但HNSCC 患者的5 年生存率仍低于50%[2]。因此亟需開發HNSCC 腫瘤治療的新靶點。

Zeste 同源增強子（enhancer of Zeste homolog 2，EZH2）是多梳抑制復合體2（polycomb repressive complex 2，PRC2）的催化亞基，在細胞核內催化組蛋白甲基化，從而介導靶基因的轉錄抑制[3]。翻譯后修飾是蛋白質功能的重要調控機制，在腫瘤的發生和發展中具有重要作用。研究表明，EZH2 可以發生多種翻譯后修飾，包括磷酸化、泛素化、甲基化、糖基化等[4]，改變EZH2 的酶活性、蛋白穩定性和亞細胞定位進而影響EZH2 的功能[5-7]。其中，第21 位點絲氨酸（S21）的磷酸化是EZH2 重要的翻譯后修飾。目前，已發現p-EZH2S21在多種腫瘤（如前列腺癌、膠質母細胞瘤和肺癌[8-10]等）的腫瘤生長、干性和耐藥等方面發揮作用。然而，在HNSCC 中p-EZH2S21的功能尚不明確。因此，本研究旨在探索HNSCC 中磷酸化EZH2 的表達特征及其對化療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 臨床組織標本及病例資料 選取2018 年1 月至2021 年3 月天津醫科大學腫瘤醫院HNSCC 患者組織標本及臨床資料53 例。整理患者臨床信息，包括患者年齡、性別、吸煙飲酒史、腫物大小、T 分期、N 分期、AJCC 分期、組織學分級及淋巴結轉移情況。所有標本的采集均經過被研究對象或其家屬知情同意，并通過本院倫理委員會批準（批號：Ek2020212）。

1.1.2 細胞系與培養條件 人舌鱗癌細胞系SCC15、SCC25 及UM1，人咽鱗癌細胞系Fadu，人咽頭癌胸水轉移細胞Detroit 562 均購自美國典型生物資源保藏中心。SCC15、SCC25 及UM1 細胞系使用DMEM/F12培養基；Fadu 及Detroit 562 使用DMEM 培養基，添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗，在37℃，5%CO2恒溫培養箱中培養。

1.1.3 試劑和儀器 DMEM/F12、DMEM 培養基、胎牛血清和青霉素-鏈霉素雙抗均購自美國Gibco 公司?？瞻讓φ蛰d體（Vector）、EZH2 野生型（EZH2-WT）和EZH2 S21 位點突變型（EZH2-S21A，即EZH2第21 位氨基酸絲氨酸突變為丙氨酸）慢病毒購自天津舍為斯生物技術有限公司。免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋公司。多克隆兔抗人p-EZH2S21抗體購自江蘇親科生物研究中心有限公司；單克隆兔抗人EZH2 抗體和單克隆鼠抗人Ki-67 抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司；單克隆鼠抗人GAPDH 抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；多克隆兔抗人HIF-1α 抗體購自美國Gene Tex 公司；單克隆兔抗人p-STAT3Y705抗體購自英國Abcam 公司。BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific 公司。順鉑（cisplatin，DDP）和5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）購自美國Selleck 公司。CCK8 試劑購自北京Biosharp 公司。

1.2 方法

1.2.1 穩轉細胞系的構建轉染與篩選 常規消化細胞，計數，吸取5×104細胞接種于6 孔板，貼壁后使用，轉染Vector、EZH2-WT 與EZH2-S21A 慢病毒，72 h后采用嘌呤霉素篩選。

1.2.2 Western blot 實驗 取處于對數生長期的細胞，使用IP 裂解液提取細胞總蛋白。采用BCA 法測定蛋白吸光度。加入SDS-PAGE 上樣緩沖液，100℃金屬浴使蛋白變性。10% SDS-PAGE 電泳后轉膜至已預先活化的PVDF 膜。用5% 脫脂牛奶或牛血清白蛋白封閉1 h。TBST 溶液清洗3 遍后，一抗4℃孵育過夜。使用帶有辣根過氧化物酶的二抗室溫孵育1 h。使用ECL 發光液曝光圖像。

1.2.3 免疫組織化學實驗 HNSCC 石蠟組織切片在65℃烘箱烤片3 h，經脫蠟，水化，抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶，封閉后加入一抗4℃孵育過夜。復溫后加入二抗，DAB 顯色，核復染，脫水，封片后在顯微鏡下觀察并采集圖像。染色強度分為：無著色、淺黃、深黃、深棕，分別計為0～3 分；染色范圍分為0～25%、25%～50%、50%～75%、75%～100%，分別計為1～4 分。染色強度與范圍的乘積為總分?？偡帧? 分為高表達，<6 分為低表達，Ki-67 表達測定方法：每張免疫組織化學切片任意選取5 個高倍鏡視野（×400），統計每個視野陽性細胞數目，計算5 個視野陽性細胞數目平均值。Ki-67 陽性表達百分率=陽性表達細胞數/視野內總細胞數。以Ki-67 陽性表達百分率<20%為低表達，≥20%為高表達。

1.2.4 CCK8 實驗 將對數生長期的細胞進行常規消化、計數，按2×103/孔接種細胞于96 孔板。于37℃5%CO2恒溫培養箱中培養24 h。將DDP 和5-FU 濃度倍比稀釋后加入96 孔板中，每孔加入200 μL 溶液。每個藥物濃度設置3 個復孔，于37℃ 5%CO2恒溫培養箱中培養48 h。加入CCK8 溶液1 h 后測定450 nm吸光度值。采用GraphPad Prism v9.0 計算IC50 值。

1.2.5 平板克隆實驗 將對數生長期的細胞進行常規消化，計數，以1×103/孔接種于6 孔板，置于37℃5% CO2恒溫細胞培養箱。培養至肉眼可見克隆后PBS 清洗，多聚甲醛固定，結晶紫染色，拍照計數。

1.3 統計學分析

采用GraphPad Prism v9.0 軟件對數據進行統計學分析。計量資料以（）表示，組間差異比較采用t檢驗。計數資料采用χ2檢驗或Fisher 精確檢驗，以P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 p-EZH2S21 表達與HNSCC 進展相關

本研究對53 例臨床HNSCC 組織標本進行免疫組織化學染色。結果顯示，與正常鱗狀上皮組織相比，p-EZH2S21在腫瘤組織的表達水平升高（圖1A）。與無淋巴結轉移的腫瘤組織相比，p-EZH2S21在有淋巴結轉移的腫瘤組織的表達水平升高（圖1B）。與原發灶腫瘤組織相比，p-EZH2S21在淋巴結轉移病灶的表達水平升高（圖1C）。Western blot 實驗顯示，腫瘤組織中p-EZH2S21高于正常鱗狀上皮組織（圖1D）。根據免疫組織化學染色，將p-EZH2S21分為高表達組與低表達組，進行臨床特征相關分析。結果顯示，p-EZH2S21表達與淋巴結轉移、T 分期、N 分期、AJCC 分期及Ki-67呈正相關（均P<0.05），與患者年齡、性別等因素無顯著相關性（P>0.05，表1）。上述結果表明p-EZH2S21在HNSCC 發生發展中的重要地位。

表1 p-EZH2S21 表達與HNSCC 臨床病理特征的相關性分析 例（%）

2.2 HNSCC 腫瘤組織中p-EZH2S21 與p-STAT3Y705、HIF-1α 表達水平

采用免疫組織化學染色分析HNSCC 腫瘤組織標本中p-STAT3Y705和HIF-1α 表達情況，進一步分析p-EZH2S21和p-STAT3Y705、HIF-1α 表達相關性。結果顯示，在HNSCC 腫瘤組織中p-EZH2S21表達水平和p-STAT3Y705（P<0.05）、HIF-1α（P<0.01）表達水平均呈正相關（表2），進一步證實p-EZH2S21在HNSCC 中的重要地位。

2.3 EZH2 通過S21 位點磷酸化對HNSCC 細胞的增殖能力

通過體外實驗進一步驗證p-EZH2S21在HNSCC發生發展中的作用。使用Western blot 實驗檢測多個HNSCC 細胞系中p-EZH2S21的表達情況（圖2A），其中p-EZH2S21在SCC15 細胞中表達最低，因此，選用SCC15 細胞系構建EZH2 野生型（EZH2-WT）和EZH2 S21 位點突變（EZH2-S21A）穩轉細胞系。與空載對照組相比，EZH2-WT SCC15 細胞中EZH2 及p-EZH2S21蛋白水平升高。與EZH2-WT SCC15 細胞相比，EZH2-S21A SCC15 細胞中EZH2 蛋白水平不變，p-EZH2S21蛋白水平降低（圖2B）。然后，使用CCK8 實驗和平板克隆實驗觀察EZH2 及EZH2 S21對腫瘤細胞增殖能力的影響。與空載對照組（237±3）相比，過表達EZH2 后細胞活力增強，平板克隆數增多（404.7±9.866），增殖能力增強（t=28.16，P<0.000 1）。與EZH2-WT SCC15 細胞相比，S21 位點突變后，細胞活力減弱，平板克隆數減少（268±10），增殖能力降低（t=16.85，P<0.000 1）。以上結果表明，EZH2 通過S21 影響HNSCC 的增殖能力（圖2C，2D）。

圖2 EZH2 通過S21 位點磷酸化促進HNSCC 細胞的增殖能力

2.4 EZH2 通過S21 位點磷酸化影響HNSCC 細胞及對DDP 和5-FU 的關系

細胞增殖與腫瘤治療敏感性密切相關，因此本研究進一步探討EZH2 S21 在HNSCC 化學治療中的作用，觀察EZH2 及EZH2 S21 對化療敏感性的影響。用DDP 或5-FU 處理空白對照、EZH2-WT 及EZH2-S21A SCC15 細胞，進行CCK8 實驗和平板克隆實驗。結果顯示，加入DDP（圖3A，3B）或5-FU（圖3C，3D）后，與空白對照（DDP：123.7±7.371，5-FU：168.7±3.055；IC50DDP：2.819 μM，IC505-FU：2.687 μM ）相比，過表達EZH2 后（DDP：342.7±7.024，5-FU：303.7±6.658；IC50DDP：4.537 μM，IC505-FU：3.754 μM）細胞對DDP或5-FU 的敏感性降低，其對細胞增殖的抑制能力減弱（tDDP=37.26，P<0.000 1；t5-FU=31.92，P<0.000 1）。而S21 位點突變后（DDP：197±4.583，5-FU：188.3±4.726；IC50DDP：3.728 μM，IC505-FU：2.895 μM），細胞恢復對DDP 或5-FU 的敏感性，其對細胞增殖抑制能力增強（tDDP=30.08，P<0.000 1；t5-FU=24.47，P<0.000 1）。上述結果說明EZH2 通過S21 位點磷酸化影響腫瘤細胞對化療的敏感性。

圖3 EZH2 通過S21 位點磷酸化影響HNSCC 細胞對DDP 和5-FU 治療敏感性

3 討論

腫瘤的乏氧微環境會激活腫瘤細胞一系列分子信號途徑，如HIF-1α 和STAT3[11]。本研究發現p-EZH2S21在HNSCC 患者腫瘤細胞中的表達水平與p-STAT3Y705和HIF-1α 的表達水平呈正相關，因為在腫瘤組織中p-EZH2S21與HIF-1α、p-STAT3Y705均呈高表達。此外，在HNSCC 中p-EZH2S21表達與淋巴結轉移、T 分期、N 分期和AJCC 分期呈正相關。體外實驗證明EZH2 通過S21 位點磷酸化影響腫瘤細胞對化療的敏感性。EZH2 在HNSCC 中表達明顯升高，并與其惡性生物學行為密切相關。本課題組前期研究發現，HNSCC 腫瘤組織中EZH2 表達高于正常鱗狀上皮。抑制EZH2 表達通過影響線粒體內鈣離子濃度調控線粒體膜電位反轉，影響腫瘤細胞的衰老和凋亡過程[12]。

p-EZH2S21是EZH2 重要的磷酸化形式，在HNSCC、膠質母細胞瘤等多種惡性腫瘤中表達明顯增高[8，13]。p-EZH2S21異常激活與多種惡性腫瘤的侵襲轉移、化療耐藥及干性密切相關[8，10]。S21 的磷酸化修飾對EZH2 發揮非組蛋白賴氨酸甲基化功能至關重要，p-EZH2S21能促進STAT3 的甲基化并使其轉化為激活狀態[8]。此外，EZH2 通過調節雄激素受體及相關蛋白的甲基化從而發揮轉錄激活的作用。其中，S21 位點的磷酸化是EZH2 發揮甲基轉移酶所必需的[10]。

目前，EZH2 已成為腫瘤治療的重要靶點。然而，隨著大量腫瘤治療的研究進展，EZH2 抑制劑表現出一定的耐藥性及不良反應。翻譯后修飾通過調節蛋白質的結構、空間定位和相互作用從而控制其功能。研究表明，協同靶向EZH2 與其上游PI3K 或AKT 克服了PI3K 或KRAS 特異性突變腫瘤患者對PI3K/AKT靶向治療的抵抗問題[9，14]。本研究為探討以p-EZH2S21為核心的翻譯后修飾調控網絡提供了新思路。然而，臨床治療中尚未研發出針對p-EZH2S21的治療策略。本研究揭示了EZH2 在HNSCC 發生發展中的機制，即通過S21 位點磷酸化增加化療敏感性。因此，深入研究p-EZH2S21的功能，開發針對p-EZH2S21的藥物或單克隆抗體將為治療HNSCC 開辟新途徑。

本文無影響其科學性與可信度的經濟利益沖突。