載rhBMP-2 聚乳酸/磷酸鈣支架在兔脊柱融合中的應用

王 萌， 張 爽， 王 靖， 曹雪華， 岳述榮， 劉昌勝

（1.上海瑞邦生物材料有限公司, 上海 201707；2.華東理工大學材料科學與工程學院, 上海 200237）

脊柱融合術是目前治療脊柱退變性疾病的常用手術方法[1-2]，而植骨未融合等是脊柱融合術后需要二次手術的常見原因[3]。如何提高脊柱融合率、減少二次手術、減輕患者痛苦，成為急需解決的問題。通過植骨使脊柱達到骨性融合，是脊柱融合術成功的關鍵[4]，因此提高植骨材料的骨誘導活性從而促進骨性融合具有重要意義[5]。目前自體骨移植由于其誘導成骨活性作用好，仍是骨移植材料的金標準，但由于其獲取來源有限、患者痛苦增加、手術時間延長等原因，臨床使用受到限制[6]。

重組人骨形態發生蛋白-2（recombinant human Bone Morphogenetic Protein-2, rhBMP-2）是一種具有骨誘導活性的生長因子，能夠快速有效誘導成骨[7-8]，已被廣泛用于脊柱融合手術[9-12]。目前臨床上可用于脊柱融合的骨形態發生蛋白-2（BMP-2）產品主要以膠原或磷酸鈣鹽為載體。以膠原為載體的BMP-2 產品主要為美敦力INFUSE Bone Graft，在2002 年通過美國FDA 批準用于脊柱融合，臨床治療效果良好。但其存在降解過快、植入初期rhBMP-2 突釋等不足，可能導致并發癥的產生[13-14]。Cho 等[15]研究了負載rhBMP-2 的羥基磷灰石（HA）用于腰椎橫突間融合的安全性和有效性，研究發現，當rhBMP-2 使用劑量為0.1 mg/kg 時，患者未出現rhBMP-2 引起的并發癥，且能夠在3 個月時形成脊柱融合。但是單純的無機材料作為rhBMP-2 載體存在脆性大、植入后降解慢等缺點。

本文通過有機/無機復合的思路，以臨床應用廣泛的醫用高分子材料聚乳酸（PLA）、聚己內酯（PCL）和無機材料β-磷酸三鈣（β-TCP）為主要成分制備有機/無機復合多孔支架，使材料具有合適的降解速率；并負載rhBMP-2 使該支架具有骨誘導活性，進一步通過羥丙甲基纖維素（HPMC）涂覆于支架表面使rhBMP-2 緩釋，延長rhBMP-2 誘導骨修復的時間，促進新骨持續生成。通過兔脊柱融合植骨實驗評價了HPMC改性的載rhBMP-2 聚乳酸/磷酸鈣支架應用于脊柱融合的可行性。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

四 水 硝 酸 鈣（Ca(NO3)2·4H2O）、磷 酸 氫 二 銨（ （NH4)2HPO4） 、 氨 水（NH3·H2O ） 、 無 水 乙 醇（C2H5OH）：分析純，永華化學科技（江蘇）有限公司；外消旋聚乳酸（PDLLA）、PCL：醫用級，山東省藥學科學院中試廠；二氯甲烷（CH2Cl2）、氯化鈉（NaCl，380～550 μm）：分析純，永華化學科技（江蘇）有限公司；HPMC：醫用級，山東聊城阿華制藥有限公司；rhBMP-2：醫用級，上海瑞邦生物材料有限公司。

1.2 測試與表征

pH 計：上海儀電科學儀器股份有限公司，PHS-3C 型；電子天平：上海恒平科學儀器有限公司，MP5002 型；磁力攪拌器：上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司，H01-1A 型；馬弗爐：上海鉅晶精密儀器制造有限公司，SXL-1700C 型；冷凍干燥機：上海田楓實業有限公司，TF-FD-1PF 型；電導率儀：上海儀電科學儀器股份有限公司，DDS-307A 型；Micro-CT：德國Bruker 公司，SkyScan1076 型；電子萬能試驗機：美特斯工業系統（中國）有限公司，CMT2503 型；倒置顯微鏡：德國萊卡公司，DMi8 型；掃描電子顯微鏡：日本日立公司，S-3400N 型；X 射線衍射儀：日本理學電機，D/max2550VB/PC 型。

1.3 實驗步驟

1.3.1 支架制備 通過物理混合法和氯化鈉顆粒占位造孔法制備聚乳酸/磷酸鈣多孔支架，將rhBMP-2 溶液吸附于支架表面，冷凍干燥得到載rhBMP-2 的支架，再將表面涂覆HPMC 涂層，得到HPMC 改性的載rhBMP-2 支架。

（1）β-TCP 粉末制備 采用液相沉淀法制備β-TCP 粉末。稱取280.20 g Ca(NO3)2·4H2O 溶于2.40 L純化水，配制得到鈣溶液。稱取104.30 g (NH4)2HPO4溶于1.58 L 純化水，配制得到磷溶液。將氨水和純化水按體積比1∶1 混合，得到氨水溶液。制備時，將鈣溶液以10 mL/min 的速率滴入磷溶液中，同時滴加氨水溶液使反應體系pH 保持在7.0，待滴加完畢，室溫繼續反應3 h。反應結束后過濾，將濾餅用無水乙醇洗滌3 遍并烘干，800 ℃煅燒2 h，自然降溫至室溫后取出，得到β-TCP 粉末。采用X 射線衍射儀對β-TCP 粉末進行分析，掃描范圍10°～80°，工作電壓40 kV，工作電流100 mA。

（2）聚乳酸/磷酸鈣多孔支架制備 將醫用級外消旋聚乳酸和聚己內酯以質量比1∶1 溶解于二氯甲烷中，加入β-TCP 粉末并磁力攪拌至分散均勻，待溶劑揮發至溶液黏稠時加入NaCl 顆粒，攪拌均勻后填入聚四氟乙烯模具（25 mm×5 mm×3 mm），自然揮發24 h 后脫模。將所得樣品浸泡于純化水中，每4 h 換一次水。當浸泡樣品的水溶液電導率低于20 μS/cm時，取出支架，37 ℃烘干12 h，得到聚乳酸/磷酸鈣多孔支架。PDLLA、PCL、β-TCP 粉末、NaCl 顆粒的質量比為12∶12∶16∶3。通過掃描電子顯微鏡觀察支架形貌，噴金時間40 s，工作電壓10 kV。

（3）載rhBMP-2 聚乳酸/磷酸鈣多孔支架制備將上述制備的多孔支架經25 kGy 輻照滅菌后，在無菌環境下將200 μL rhBMP-2 溶液 （1 mg/mL）均勻滴加在支架表面，凍干后得到載rhBMP-2 多孔支架。

（4）HPMC 改性的載rhBMP-2 聚乳酸/磷酸鈣多孔支架制備 將HPMC 溶于純化水中制備成w=2%的水溶液，并用0.22 μm 無菌過濾器過濾。在無菌環境下，將200 μL rhBMP-2 溶液（1 mg/mL）均勻滴加在支架表面，待完全吸附后，將HPMC 溶液滴在支架表面，凍干后得到HPMC 改性的載rhBMP-2 多孔支架。

1.3.2 脊 柱 融 合 實 驗 本 文 擬 通 過 兔 后 外 側L5-L6 橫突間植骨融合模型[16-17]，考察聚乳酸/磷酸鈣多孔支架對脊柱融合的可行性。實驗分為4 組，即聚乳酸/磷酸鈣多孔支架組（Scaffold，S），載rhBMP-2 的聚乳酸/磷酸鈣多孔支架組（Scaffold/rhBMP-2，S/B），HPMC 改性的載rhBMP-2 多孔支架組（Scaffold/rhBMP-2/HPMC，S/B/H）和自體髂骨組（Autogenous iliac crest bone graft，ICBG）。選擇3 月齡普通級雄性新西蘭大白兔共56 只，每組14 只，體重2.5～3.0 kg，由上海甲干生物科技有限公司提供并飼養，分別在植骨融合術后28 d、56 d 和84 d 處死取材。

（1）植入手術 實驗在無菌環境下操作。植入材料分別為多孔支架（圖1（a））和自體髂骨（圖1（b））。取后正中入路，雙側旁開約2 cm 經椎旁肌肉間隙暴露L5 和L6 橫突（圖1（c）），去除橫突部分皮質后植入材料（圖1（d）），逐層縫合。術后連續3 d 予抗生素注射。飼養期間定期觀察動物的飲食等一般情況以及切口局部情況，期間動物自由攝食。

圖1 兔后外側脊柱融合植入示意圖Fig.1 Illustration of rabbit posterolateral spinal fusion

（2）micro-CT 掃描觀察 術后分別在28 d、56 d和84 d 處死動物，取出腰椎植骨部位（圖1（e）），經w=4%多聚甲醛固定后，使用micro-CT 機對植骨區域進行掃描分析。儀器工作電壓49 kV，電流200 μA，分辨率36.5 μm。通過SkyScan CTVOX 2.1 軟件進行三維重建，觀察新骨生成情況。

（3）Van Gieson（VG）染色 樣本經w=4% 多聚甲醛固定后，甲基丙烯酸甲酯（PMMA）包埋、切片、磨片最終得到約40 μm 的切片，通過Van Gieson（VG）染色液染色，顯微鏡觀察組織形態。

（4）生物力學 采用電子萬能試驗機對各組實驗節段的前屈、背伸活動度進行檢測，并對實驗節段進行拉伸分離實驗，比較各組的椎體融合情況。

進行屈伸實驗前，修整脊柱標本使其前后面平整。將標本固定在電子萬能試驗機的固定裝置上，使其處于固定裝置的中央。探頭移動速率設置為1 mm/min，探頭最大應力達10 N 時停止測試，記錄此時探頭的位移量。對脊柱標本分別進行前屈、背伸測試。

進行拉伸分離實驗前，去除脊柱標本的椎間盤，在椎體間分別向上、向下置入兩根醫用鋼絲，將鋼絲兩端固定在萬能試驗機的拉伸裝置上，探頭移動速率設置為10 mm/min。實驗過程中檢測到的最大拉伸應力值即為實驗節段的斷裂力，并記錄對應的位移量。

（5）統計學分析 所有數據采用Origin (OriginLab Corp., Northhampton, MA, USA)進行分析，數據以平均值±標準差表示。采用單因素方差分析（ANOVA）進行統計學比較，在大于95%的置信水平時，實驗數據之間差異具有統計學意義（p< 0.05）。

2 結果與討論

PLA 是一種被廣泛應用的醫用高分子材料，在體內可通過水解作用降解，但其不具有骨傳導作用，且降解時會降低局部組織的pH，不利于骨修復[18-19]。因此，本文通過在聚乳酸中引入β-TCP 來改善因降解產生的酸性[20]，并提高支架親水性，以此賦予支架良好的骨傳導能力。由于PLA 本身具有一定的剛度，添加柔韌性較好的PCL 可使多孔支架具有可塑性，避免因受力而斷裂[21-22]。通過負載rhBMP-2賦予支架骨誘導性，并進一步通過表面涂覆HPMC使rhBMP-2 能夠緩慢釋放。前期研究表明，HPMC 表面涂層改性的載rhBMP-2 聚乳酸/磷酸鈣支架具有較好的誘導成骨作用[23]。本文通過兔后外側橫突間植骨融合實驗，證明了該支架用于脊柱融合可達到與自體骨相近的融合效果，可作為自體骨的替代選擇。

2.1 支架表征

圖2（a）為制備的β-TCP 粉末XRD 圖譜，與磷酸三鈣（PDF 粉末衍射卡9-169）的主要衍射峰一致。圖2（b）為聚乳酸/磷酸鈣多孔支架形貌圖，可以觀察到支架內部豐富的多孔結構，孔徑范圍200～500 μm。從圖2（c）可以觀察到，支架骨架上粒徑約1 μm 的β-TCP。支架豐富的多孔結構為新骨生成提供了有利條件。

圖2 聚乳酸/磷酸鈣支架表征Fig.2 Characterization of polylactic acid/calcium phosphate scaffolds

2.2 micro-CT

從圖3 所示的三維重建和二維截面圖中可以看出，聚乳酸/磷酸鈣支架（S）在植入體內后28 d 已發生降解，84 d 時橫突間有少量新骨生成；載rhBMP-2 支架（S/B）和HPMC改性的載rhBMP-2支架（S/B/H）在28 d 時支架內部已有新骨生成，84 d 時橫突間形成了連續的骨組織結構，表現出良好的融合效果；自體髂骨（ICBG）植入后28 d 時與橫突開始融合，84 d 時L5-L6 間達到融合。

圖3 材料植入后兔脊柱的Micro-CT 重建圖Fig.3 Micro-CT reconstruct images of the rabbit spine post-operation

圖4 所示為各組在不同時期的植骨區骨體積分數和骨密度定量分析。從圖中可以看出， S/B 和S/B/H 組的骨體積分數和骨密度在不同時間點均高于S 組，說明rhBMP-2 的釋放誘導了新骨快速生成。在第56 d 和84 d 時， S/B/H 組的骨體積分數與骨密度高于S/B 組，最接近ICBG 組的融合效果，說明rhBMP-2的緩慢釋放進一步提高了材料的促成骨作用。

圖4 Micro-CT 定量分析Fig.4 Quantitative analysis of micro-CT

2.3 VG 染色

圖5 為材料植入后84 d 組織切片VG 染色圖，圖中黑色部分為植入材料，紅色為骨組織。白色虛線上部為材料植入區域，白色虛線下部為脊柱橫突骨組織。在降解方面，從圖5 可見S 和S/B 組支架均發生了明顯的降解，而S/B/H 組由于存在HPMC 涂層，降解較S、S/B 組慢。在成骨方面，S 組新骨生成作用有限， S/B 組在交界處可見明顯新生骨組織， S/B/H組內部生成的新生骨組織最多。

圖5 材料植入84 d 時組織切片VG 染色Fig.5 VG staining of bone tissue at 84 d

2.4 生物力學

通過考察融合節段的剛度和拉伸強度來評價融合效果。圖6（a）所示為材料植入84 d 后脊柱前屈和背伸的撓度，以萬能試驗機探頭應力達到10 N 時探頭的位移量表示。由圖可得ICBG 組前屈和背伸的撓度最低，說明ICBG 組脊柱剛度最大，融合效果最好。在3 組支架材料中， S/B/H 組前屈和背伸的撓度最接近于ICBG組，表明S/B/H 組的融合效果最接近于自體骨。

圖6 材料植入后84 d 脊柱生物力學分析Fig.6 Biomechanical evaluation of spines at 84 d post-operation

圖6（b）所示為材料植入84 d 后脊柱的拉伸強度，以斷裂時力與相應位移的比值表示。從圖6（b）可以看出，ICBG 組的拉伸強度最高，融合效果最好。3 組支架材料中， S/B/H 組的拉伸強度高于S 組和S/B 組，且最接近ICBG 組，說明S/B/H 釋放的rhBMP-2 能夠有效促進橫突間新骨生長而進一步提高融合效果，可作為自體骨的替代物。

從micro-CT、VG 染色和生物力學結果可以看出，單純聚乳酸/磷酸鈣支架促進成骨的作用有限；支架負載rhBMP-2 后使橫突間形成了明顯的骨小梁結構，成骨量顯著增加；HPMC 涂層改性使支架能夠緩慢釋放rhBMP-2[23]，延長rhBMP-2 的作用時間，持續有效的誘導成骨作用使HPMC 涂層改性的載rhBMP-2支架在生物力學方面達到了接近自體骨的融合效果，能夠使椎體間形成骨性融合。

rhBMP-2 優異的誘導成骨作用已經得到了大量基礎研究及臨床應用的證實[12,24-26]，但其安全性也越來越引起重視。據報道，rhBMP-2 相關的副作用包括炎癥、破骨細胞介導的骨吸收、脂肪化等，尤其在應用于頸椎融合時，易出現頸部腫脹和吞咽、呼吸困難，但目前仍存在爭議[27]。目前rhBMP-2 相關副作用的報道以膠原海綿載體為主，應用在脊柱融合時每融合節段使用劑量高達4.2～12 mg[28]，且rhBMP-2在膠原海綿上主要為擴散釋放模式，停留時間為5 d 左右[29]。因此，rhBMP-2 副作用的產生可能與過高的使用濃度或過快的釋放速率有關[14]。Wen 等[30]總結了2003 年至2017 年rhBMP-2 應用于頸椎融合的有效性和并發癥情況，發現rhBMP-2 劑量越高越易出現并發癥，推薦使用劑量為每節段0.7 mg。在控制使用劑量的同時，控制釋放速率也很關鍵。本文制備的HPMC 改性載rhBMP-2 支架中rhBMP-2 隨HPMC 涂層的降解而緩慢釋放，前期研究顯示，7 d時rhBMP-2 體外釋放量累計為50%，且始終保持較低的釋放速率，而未經HPMC改性的支架7 d 時rhBMP-2 體外釋放量為70%[23]。因此，以HPMC 涂層改性的聚乳酸/磷酸鈣支架體系作為rhBMP-2 載體，不僅具有良好的可降解性和骨傳導性，而且在發揮持續有效的骨誘導作用的同時，可避免因rhBMP-2 局部濃度過高而可能產生的不良反應。

3 結 論

（1）制備了具有可塑性的聚乳酸/磷酸鈣多孔支架，并將活性因子rhBMP-2 負載于支架表面，進一步通過HPMC 涂層對支架表面進行改性。支架豐富的多孔結構為新骨生成提供了有利條件。

（2）通過兔脊柱融合實驗證明了HPMC 涂層改性的載rhBMP-2 聚乳酸/磷酸鈣多孔支架在促進脊柱融合方面的良好作用。Micro-CT、VG 染色和生物力學實驗結果表明該支架能夠誘導椎體間新骨生成，脊柱達到骨性融合，可作為替代自體骨的理想植骨材料之一。