烏梅總黃酮調控miR-145-3p 表達對MPP+誘導SH-SY5Y 細胞損傷的作用及其機制

文曉東, 王春玲, 蔣媛靜, 周欣梅, 張 藝, 伍 媛

（1. 廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院腦病一區，廣西 南寧 530011； 2. 廣西中醫藥大學藥學院藥理教研室，廣西 南寧 530200）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種常見的慢性神經退行性疾病，由黑質多巴胺能神經元的進行性丟失引起，并產生運動癥狀和非運動癥狀［1］。研究［2］顯示：線粒體功能障礙會影響多巴胺能神經元功能，干擾PD 相關通路的基因表達，導致細胞死亡，是PD 發病機制之一。線粒體自噬是細胞隔離并清除受損線粒體的主要方式，對細胞功能和生存維持至關重要［3］。研究［4］顯示：特發性PD 患者的線粒體自噬減少，刺激線粒體自噬以維持線粒體健康是延緩PD 患者神經退行性過程的有效方法。

微小RNA （microRNA，miRNA） 作為神經退行性疾病的調節因子，參與調控多種神經性疾病的發生發展。其中，miR-145-3p 可靶向多發性骨髓瘤細胞中的組蛋白去乙?；? 觸發自噬過程，在唾液中還可作為PD 的輔助生物標記［5-6］。目前采用中草藥輔助治療的PD 患者占全部患者的25.7%~76.0%［7］。中草藥中的黃酮類成分可以保護細胞線粒體功能，避免結構損傷，保護PD 模型動物的神經功能［8］。 烏梅總黃酮（fructus mume total flavone，FMF） 是烏梅主要有效成分，本課題組前期研究［9-10］顯示：FMF 可對多巴胺能毒素1-甲基-4- 苯基吡啶（dopaminergic toxin 1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP＋） 誘導的SH-SY5Y 細胞損傷發揮保護作用，并證實FMF 可通過影響線粒體呼吸鏈酶復合物的活性防治PD。但FMF 靶向線粒體對MPP+誘導的SH-SY5Y 細胞損傷發揮保護作用的具體機制尚未完全闡明。因此，本研究構建PD 細胞模型，探討FMF 調控miR-145-3p 對MPP+誘導的SH-SY5Y 細胞損傷的保護作用，為深入研究PD 的發病機制和尋找新的治療靶點提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器SH-SY5Y 人神經母細胞瘤購自中國科學院細胞庫。FMF 純度為95%（貨號13057-72-2，西安賽奧生物科技公司），MPP＋（貨號N137206，上海阿拉丁試劑有限公司），CCK-8、RIPA（強）組織細胞快速裂解液和BCA 蛋白濃度測定試劑盒（貨號CA1210、R0010和PC0020，北京索萊寶生物有限公司），Opti-MEM和胎牛血清（貨號31985-062 和10270-106， 美國Gibco 公司），Lipofectamine?RNAiMAX （貨號13778030， 美國Invitrogen 公司） Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（貨號556547，美國BD公司），聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF） 和化學發光試劑（貨號IPVH00010 和WBKLS0500，美國Millipore 公司），醋酸鈾（西安鼎天化工公司），枸櫞酸鉛（貨號GA10701，北京中鏡科儀公司），兔抗Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和 GAPDH 單克隆抗體 （ 貨號 PAB35215、PAB34124、 PAB30656 和 PAB36269， 武 漢Bioswamp 公司）。311 型CO2恒溫培養箱（美國Thermo 公司），AMR-100 型酶標儀（杭州奧盛儀器有限公司），DMIL LED 型倒置熒光顯微鏡（德國Leica 公司），NovoCyte 型流式細胞儀（天津艾森生物有限公司），Tanon-5200 型全自動化學發光分析儀（上海天能公司），mini protean3 cell 型電泳槽（美國BIO-RAD 公司），HT7700 型透射電鏡（日本日立公司）。

1.2 MPP+誘導SH-SY5Y 細胞損傷模型的構建調整SH-SY5Y 細胞懸液濃度，37 ℃、5%CO2環境下培養使細胞貼壁。將MPP＋稀釋為0、125、250、500、1 000 和2 000 μmol·L－1后處理細胞，繼續培養12、24 和48 h。每孔加入10 μL CCK-8 溶液，培養4 h，采用酶標儀于波長450 nm 處檢測吸光度（A）值。以A值代表SH-SY5Y 細胞增殖活性，A 值降低代表細胞增殖活性受損，SH-SY5Y細胞損傷模型構建成功。采用Graphpad Prism 9 軟件計算MMP+干預SH-SY5Y 細胞12，24 和48 h 的半抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50），計算細胞存活率。細胞存活率=（測量孔A 值－空白孔A值）/（對照孔A值－空白孔A值）×100%。

1.3 FMF 最佳作用時間和干預濃度將正常培養的SH-SY5Y 細胞分別給予0、0.031 25、0.062 50、0.125 00、0.250 00、0.500 00 和1.000 00 g·L－1FMF 干預處理，分別干預12、24和48 h，CCK-8 法檢測細胞增殖能力，以波長490 nm 處A 值變化情況確定FMF 最佳作用時間。 將正常培養的SH-SY5Y 細胞隨機分為正常培養組、MPP＋誘導組（500 μmol·L－1MPP＋作用24 h） 和MPP＋+不同劑量FMF 組（500 μmol·L－1MPP＋作用24 h+0.125 00、0.250 00、0.500 00 和1.000 00 g·L－1FMF 干預24 h）。采用CCK-8 法檢測各組細胞增殖能力，與MPP＋誘導組比較，以波長490 nm處A 值增加最明顯的FMF 作用濃度為FMF 最佳干預濃度。

1.4 細胞分組和CCK-8 法檢測各組細胞增殖能力根據miR-145-3p基因序列設計合成miR-145-3p引物，將目的片段與載體重組獲得重組質粒，并將miR-145-3p 的mimics 及對應的NC 質粒轉入MPP＋誘導的PD 細胞模型中。將細胞分為對照組（未經處理）、模型組（500 μmol·L－1MPP＋作用24 h）、MPP＋+mimics 組（轉染miR-145-3p mimics）、MPP＋+NC 組（轉染miR-145-3p NC）、MPP＋+FMF 組（0.25 g·L－1FMF 作用24 h）、MPP＋+mimics+FMF 組 （ 轉染 miR-145-3p mimics 后0.25 g·L－1FMF 作用24 h） 和MPP＋+NC+FMF組（轉染miR-145-3p NC 后0.25 g·L－1FMF 作用24 h）。除對照組外，其余各組均經500 μmol·L－1MPP＋作用SH-SY5Y 細胞24 h 后再進行相應處理。加入CCK-8 試劑，檢測各組細胞于波長490 nm 處A 值，以A（490）值代表各組細胞增殖能力。

1.5 AnnexinⅤ-FITC/PI 染色法檢測各組細胞凋亡率收集各組細胞調整濃度，取1×106個細胞，400 g、4 ℃離心5 min，棄上清。加入預冷的PBS緩沖液與細胞混勻，再次離心。細胞重懸，加入10 μL AnnexinⅤ-FITC 和PI，輕輕混勻，4 ℃避光孵育30 min 后加入PBS 緩沖液，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。細胞凋亡率=（早期凋亡細胞數+晚期凋亡細胞數）/細胞總數×100%。

1.6 透射電鏡觀察各組細胞中線粒體自噬超微結構表現收集各組細胞，經戊二醛和鋨酸固定，丙酮和環氧樹脂浸透，采用特制的塑料包埋板加入包埋劑，置入聚合包埋箱聚合。去除組織周圍的包埋介質，半薄切片后移至滴加0.5%甲苯胺藍染色液的載玻片上，染色后切片。醋酸鈾避光染色、水洗，再用枸櫞酸鉛避光染色、水洗、濾紙吸干，于透射電鏡下觀察并拍照。

1.7 實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR， RT-qPCR）法檢測各組細胞中miR-145-3p 表達水平TRIzol 法提取各組細胞總RNA，逆轉錄獲得cDNA，進行擴增。反應條件：95 ℃預變性3 min，擴增95 ℃、5 s，56 ℃、10 s，72 ℃、25 s，共40 個循環，最后65 ℃~95 ℃制備熔解曲線。引物序列為miR-145-3p F：5′-GGGGTCCAGTTTTCCC-3′，miR-145-3p R：5′-CTGGTGTCGTGGAGTCGG-3′；U6 F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′； U6 R： 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6 為內參，采用2－ΔΔCt法計算各組細胞中miR-145-3p 表達水平。

1.8 Western blotting 法檢測各組細胞中Beclin-1蛋白表達水平和LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值將細胞組織剪碎，加入強裂解液，勻漿直至完全裂解。離心電泳后濕法轉膜，加入5%的脫脂奶粉室溫封閉4 ℃過夜。根據說明書稀釋一抗（1∶1 000），與膜室溫孵育1 h。PBST 緩沖液洗滌后，加入HRP 標記的二抗（1∶2 000），與膜室溫孵育1 h。ECL 發光液充分與膜接觸后，全自動化學發光分析儀分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH 為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1.9 統計學分析采用GraphPad Prism 9.0 統計軟件進行統計學分析。FMF 最佳干預濃度、細胞增殖能力、細胞凋亡率、各組細胞中miR-145-3p表達水平和Beclin-1蛋白表達水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均符合正態分布，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用Student’st檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 MPP+誘導SH-SY5Y 細胞損傷的最佳作用濃度和時間不同濃度的MPP＋作用SH-SY5Y 細胞后，細胞增殖能力明顯降低（P<0.01），提示PD細胞模型構建成功，且細胞增殖能力降低呈作用濃度和作用時間依賴性。干預12、24 和48 h， MPP＋誘導SH-SY5Y細胞IC50值分別為（986.23±42.53）、（550.93±13.97）和（358.30±21.57）μmol·L－1，500 μmol·L－1MPP＋干預24 h 作用效果最佳，此時細胞存活率為（53.67±0.64）%。見圖1。

圖1 MPP＋作用濃度和時間Fig. 1 Concentration and duration of MPP+ action

2.2 FMF最佳干預濃度和作用時間0、0.031 25、0.062 50、0.125 00 和0.250 00 g·L－1FMF 對SH-SY5Y 細胞增殖能力無明顯影響；0.500 00 和1.000 00 g·L－1FMF 對SH-SY5Y 細胞增殖能力影響較小。與正常培養組比較，MPP＋誘導組細胞增殖能力明顯降低（P<0.01）。與MPP＋誘導組比較，MPP＋+不同劑量FMF 組細胞增殖能力均明顯升高（P<0.01）， 且MPP＋+0.250 00 g·L－1FMF 組細胞增殖能力升高最明顯。因此，FMF最佳干預濃度為0.250 00 g·L－1，最佳干預時間為24 h。見圖2。

圖2 不同作用時間（A）和干預濃度（B）FMF 作用后各組細胞增殖能力Fig. 2 Proliferation abilities of cells in various groups after treated with FMF for different time (A) and different intervention concentrations (B) of FMF

2.3 各組細胞增殖能力與對照組比較，模型組細胞增殖能力明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，MPP＋+mimics 組和MPP＋+FMF 組細胞增殖能力均明顯升高（P<0.01）。與MPP＋+FMF 組比較，MPP＋+mimics+FMF 組細胞增殖能力明顯升高（P<0.01）。見圖3。

圖3 各組細胞增殖能力Fig. 3 Proliferation abilities of cells in various groups

2.4 各組細胞凋亡率與對照組比較，模型組細胞凋亡率明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，MPP＋+mimics 組和MPP＋+FMF 組細胞凋亡率均明顯降低（P<0.01）。與MPP＋+FMF 組比較，MPP＋+mimics+FMF組細胞凋亡率明顯降低（P<0.01）。見圖4 和5。

圖4 AnnexinⅤ-FITC/PI 染色法檢測各組細胞凋亡率Fig. 4 Apoptotic rates of cells in various groups detected by AnnexinV-FITC/PI staining method

圖5 各組細胞凋亡率Fig. 5 Apoptotic rates of cells in various groups

2.5 各組細胞線粒體自噬超微結構表現對照組細胞線粒體形態均勻，結構完整；模型組細胞線粒體體積變大，結構不規則，出現空化現象。與模型組比較，MPP＋+mimics 組和MPP＋+FMF 組細胞線粒體結構改善，自噬小體數量增加。與MPP＋+FMF 組比較，MPP＋+mimics+FMF 組細胞線粒體結構較為完整，自噬小體數量進一步增加。見圖6。

圖6 透射電鏡觀察各組細胞中線粒體自噬超微結構表現（×12 000）Fig. 6 Ultrastructural morphology of mitochondrial autophagy in cells in various groups observed under transmission electron microscope(×12 000)

2.6 各組細胞中miR-145-3p 表達水平與對照組比較，模型組細胞中miR-145-3p 表達水平明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，MPP＋+mimics 組和MPP＋+FMF 組細胞中miR-145-3p 表達水平均明顯升高（P<0.01）。與MPP＋+FMF 組比較，MPP＋+mimics+FMF 組細胞中miR-145-3p 表達水平明顯升高（P<0.01）。見圖7。

圖7 RT-qPCR 法檢測各組細胞中miR-145-3p 表達水平Fig. 7 Expression levels of miR-145-3p in cells in various groups detected by RT-qPCR method

2.7 各組細胞中Beclin-1 蛋白表達水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與對照組比較，模型組細胞中Beclin-1 蛋白表達水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均降低（P<0.05）。與模型組比較，MPP＋+mimics 組和MPP＋+FMF 組細胞中Beclin-1 蛋白表達水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明顯升高（P<0.01）。與MPP＋+FMF 組比較，MPP＋+mimics+FMF 組細胞中Beclin-1 蛋白表達水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明顯升高（P<0.01）。見圖8。

圖8 Western blotting 法檢測各組細胞中Beclin-1 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（C）Fig. 8 Electrophoregram(A) and histograms(B) of expression of Beclin-1 protein and ratios of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ(C) in cells in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

全球約2%的60 歲以上人群受PD 影響，引發快速眼動睡眠行為障礙、嗅覺減退、便秘、特征性運動困難和心理或認知問題，對患者日常生活造成較大負擔。但目前PD 的發病機制尚未完全闡明。研究［11-12］顯示：MPP+結構類似于百草枯神經毒劑，會損害黑質紋狀體系統的多巴胺能神經元，其積聚于線粒體中抑制線粒體復合物Ⅰ活性，導致腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）合成不足，線粒體膜極性喪失，線粒體損傷嚴重。MPP+造成線粒體功能障礙，使線粒體突變并導致其功能和裂變融合機制及中樞神經系統退化，是PD 發生的主要誘因［13］。本研究結果顯示：MPP+干預SH-SY5Y 細胞后，SH-SY5Y 細胞的增殖能力、自噬小體數量和線粒體自噬相關蛋白Beclin-1蛋白表達水平及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值明顯低于正常培養的細胞，表明MPP+造成SH-SY5Y 細胞線粒體自噬損傷，并導致SH-SY5Y 細胞異常凋亡。

在神經退行性疾病中，線粒體參與ATP 產生、Ca2+穩態和神經遞質代謝，維持神經元穩態［14］。作為清除細胞受損線粒體的主要手段，線粒體自噬對于細胞功能和生存至關重要［15］。XU 等［16］發現：肉桂苷A 可降低MPP+誘導的神經元和線粒體膜電位降低并促進自噬體激活，加速受損線粒體降解，減少氧化應激，保護PD 多巴胺能神經元。因此，靶向SH-SY5Y 細胞線粒體自噬損傷在PD 治療中具有關鍵作用。PD 治療多以西藥為主，但西藥的不良反應對其治療效果影響較大。類黃酮可激活靶向線粒體功能障礙并誘導神經營養因子的抗凋亡途徑，進而表現神經保護作用，是預防PD 的天然產物［17］。烏梅中黃酮含量豐富，其可誘導癌癥細胞凋亡，發揮抗炎和抗癌作用［18］。本研究結果顯示：FMF 干預SH-SY5Y 細胞損傷模型后，細胞增殖能力恢復，線粒體自噬小體數量和自噬相關蛋白Beclin-1 蛋白表達水平及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值均升高，細胞凋亡率降低。在線粒體自噬過程中，內質網膜包裹受損的線粒體形成自噬體，隨后將LC3 Ⅰ蛋白修飾為LC3 Ⅱ蛋白，促進其與溶酶體融合，線粒體自噬作用增強時，自噬標志物LC3 Ⅱ和Beclin-1 蛋白表達均上調［19］。因此，本研究結果進一步證實FMF 可抑制MPP+誘導的SH-SY5Y 細胞凋亡，促進自噬，減輕線粒體損傷。

研究［20-21］顯示： miR-145-5p 和miR-145-3p 是新的miRNA 分子，參與調控細胞侵襲、轉移、增殖和凋亡等過程，在多種病理和生理過程中發揮重要作用。LIU 等［22］研究表明：在腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）介導的炎癥損傷中，下調miR-145 表達可逆轉對線粒體活性的抑制，增加SH-SY5Y 細胞存活率。miR-145 表達上調可促進SH-SY5Y 細胞自噬，沉默miR-145 能夠逆轉SH-SY5Y 細胞自噬的促進作用［20-21］。本研究結果顯示：miR-145-3p 在MPP＋誘導PD 細胞模型中表達下調，FMF干預后表達明顯上調，SH-SY5Y細胞增殖能力增強，線粒體自噬小體數量和自噬相關蛋白Beclin-1 蛋白表達水平及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值均升高，細胞凋亡率降低。FMF 與miR-145-3p mimics 協同作用時，細胞增殖和自噬能力增加，細胞凋亡率降低。FMF 可上調miR-145-3p 表達，促進受損線粒體自噬作用，從而增強對MPP＋誘導損傷的SH-SY5Y 細胞的保護作用。

綜上所述，FMF 可通過調控miR-145-3p 抑制線粒體功能障礙，明顯減輕MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷，本文結果為深入研究PD 的發病機制及尋找新的治療靶點提供了參考。