頭部針刺對局灶性腦缺血大鼠神經功能和腦組織中HIF-1α 及VEGFR2 表達的影響及其機制

周秀玲, 叢德毓, 張 野, 張紅石

（1. 長春中醫藥大學護理學院，吉林 長春 130117；2. 吉林省中醫院推拿科，吉林 長春 130021）

缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS） 是常見的腦血管疾病，其發病率占全部腦卒中患者的60%~80%［1］。IS 的發病機制較為復雜，主要是由于腦血管栓塞導致血氧供應不足進而引起腦組織缺血性損傷，導致行為和感知等功能的缺損及障礙。腦血管內皮細胞凋亡和重構在IS 發生發展過程中起重要作用，而缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1α 是上游通路中的關鍵因子［2］。

頭部針刺是基于《靈樞經》中“頭有氣街”的理論，采用頭部針刺的方法對IS 進行治療?！敖帧笔侵溉梭w各部位中氣血聚集和通行的道路，也可稱為“氣街”，人體的胸、腹、頭和脛皆有氣街，因此《靈樞經》 動輸篇中有“四街者，氣之路徑也”［3］。頭部的氣血與身體各經脈有密切關聯，《靈樞經》邪氣臟腑病形篇中記載“十二經脈，三百六十五絡，其氣血皆上行于面而走空竅”，表明人體頭部氣血的正常運行與身體各項機能有密切關聯。頭部針刺理論將頭部劃分為頂區、頂前區、額區、枕區、枕下區、顳區和項區7 個治療分區，治療腦卒中主要選取頂區、頂前區和額區，并以頭部的重要經脈督脈作為縱向維度基準，結合頭部分區理論并兼顧通督調神理念的頭部針刺療法，目前針灸在臨床腦卒中的治療過程中被廣泛應用［4］。本研究探討頭部針刺對局灶性腦缺血大鼠模型神經功能的影響，并闡明HIF-1α 和血管內皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）促血管再生的機制，為頭部針刺治療腦卒中的應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器40 只SPF 級SD大鼠購自吉林省長春市億斯實驗動物技術有限公司，雌雄各半，實驗動物生產許可證號：SCXK（吉）-2018-0007，體質量220~230 g，于長春中醫藥大學SPF 級實驗動物中心飼養。飼養間保持23 ℃、12 h/12 h 光照周期，濕度（55±10）%，并自由飲水。實驗過程符合實驗動物倫理要求，由長春中醫藥大學倫理委員會審批（20190151）。大鼠HIF-1α 酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（中國南京建成生物工程研究所）。華佗牌一次性針灸針（0.25×13 mm，蘇州醫療用品有限公司），Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統和視頻分析系統（型號Tracking Master V3.0，北京眾實迪創科技發展責任有限公司）， 組織勻漿器（美國KONTES KIMBLE 公司），低溫高速離心機（德國Eprendorf公司），Biotek Synergy HTX 多功能微孔板檢測儀（美國寶特伯騰公司）。

1.2 大鼠局灶性腦缺血模型制備和實驗分組采用改良大腦中動脈栓塞法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）造模［5］。40 只大鼠術前24 h 禁食但自由飲水，麻醉大鼠，大鼠仰臥位固定并于頸部正中剃毛和消毒。以手術刀縱向切口，止血鉗鈍性分離組織，玻璃分針分離左側頸內動脈和頸外動脈，分別掛線備用，結扎頸外動脈和頸總動脈，夾閉頸內動脈。于頸總動脈上距離分叉2 mm 處剪1 個斜口，插入線栓，松開頸內動脈血管夾后迅速輕提掛頸內動脈上的縫合線以防止出血過多，將線栓沿頸內動脈穿過顱骨直至手下有明顯阻力時，實現大腦中動脈阻塞，導致腦缺血。結扎切口并固定線栓，剪斷多余部分縫合線和線栓，縫合傷口，注射20 萬單位青霉素，防止感染，并置于加熱墊上維持體溫恒定。術后采用《Zea-longa 評分標準》［6］對大鼠神經功能進行評定，判定大鼠局灶性腦缺血模型制備是否成功。無異常癥狀為0 分，鼠尾提起時前肢無法正常伸展為1 分，行走時偏向一側為2 分，行走困難且傾斜嚴重為3 分，有意識障礙且無法自發行走為 4 分，1~4 分視為造模成功。將術中意外死亡和造模未成功大鼠剔除實驗，并隨機選取大鼠補充。選取造模成功的20 只大鼠隨機分為模型組和治療組，每組10 只；另取10 只SD 大鼠作為假手術組，造模結束后次日，治療組大鼠進行頭部針刺治療；模型組大鼠同樣捆綁固定，但不進行治療；假手術組大鼠同樣麻醉后捆綁、分離頸部血管和結扎相應血管，但不進行造模和治療，其余步驟與另外2 組相同。造模后24 h 后觀察并記錄各組大鼠神經功能評分。

1.3 頭部針刺操作方法頭部針刺干預前大鼠麻醉固定，結合《大鼠穴位圖譜》［7］，在頂骨正中的百會穴及旁開5 mm 處進行定位取穴。頭部針刺治療先取百會穴，以0.25×13 mm 針灸針向前斜刺10 mm，再于百會穴兩側旁開約5 mm 處沿皮朝鼻尖向前斜刺10 mm，進針后以捻轉方式快速行針30 s，以5 mm×10 mm 小塊醫用膠布固定，采用叢刺法和長留針的方式，將大鼠放入無墊料籠中，配合帶針運動，留針6~8 h，每日1次，每周針刺7 次，持續2 周。

1.4 Morris 水迷宮實驗檢測各組大鼠學習記憶功能Morris 水迷宮試驗用于測試大鼠的復雜記憶和空間定位能力［8］。Morris 水迷宮由1 個直徑為160 cm 的圓形水池和圖像采集分析系統構成，周圍有遮光布，減少外界干擾。清水高度為距離站臺臺面約2 cm，將每只大鼠抓住尾巴頭朝池壁，分別由站臺對面象限放入水池，記錄各組大鼠尋找平臺時間，每次時間限制為120 s，若120 s 內未找到站臺則誘導其在站臺上站立15 s，每只大鼠4 次訓練結束，毛巾擦干水分。以各組大鼠尋找平臺時間代表大鼠的學習記憶功能。

1.5 ELISA 法檢測各組大鼠血清和腦組織中HIF-1α水平在治療周期結束后，分別將各組大鼠麻醉，剪開腹腔，腹主動脈取血5 mL，并將血液樣本于2 000 g、4 ℃離心15 min，離心后獲取上層血清。大鼠處于麻醉狀態，取血后斷頭處死，立即剝離腦組織，腦樣本按質量體積比1 g ：9 mL 的比例加入9 倍體積pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液，手工或勻漿器充分勻漿，2 000 g、4 ℃離心15 min，收集上清液備用。實驗均嚴格按照試劑盒說明書進行，檢測各組大鼠血清和腦組織中HIF-1α 水平。

1.6 Western blotting 法檢測各組大鼠腦組織中HIF-1α 和VEGFR2 蛋白表達水平剪取腦組織約0.1 g，加入細胞裂解液1 000 μL，離心5 min，取上清液，將蛋白樣品按1∶4 加入蛋白上樣緩沖液，每孔加10 μL 樣品，90 V 濃縮30 min， 120 V 分離1 h，轉膜并封閉，參考一抗說明書配制一抗稀釋液，室溫下孵育2 h， TBST 緩沖液洗滌3 次，每次5 min，參考二抗說明書配制二抗稀釋液，室溫孵育1.5 h，TBST 緩沖液洗滌3 次，每次5 min，采用ECL 發光底物試劑盒檢測蛋白條帶，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1.7 統計學分析采用SPSS 24.0 和GraphPad Prism 8 統計軟件進行統計學分析。各組大鼠神經功能評分、尋找平臺時間、血清和腦組織中HIF-1α水平及各組大鼠腦組織中HIF-1α 和VEGFR2 蛋白表達水平均符合正態分布，以x±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠術后神經功能評分假手術組大鼠未見神經功能缺陷。與假手術組比較，模型組和治療組大鼠神經功能評分升高（P<0.05）。模型組和治療組大鼠神經功能評分比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 各組大鼠神經功能評分Tab. 1 Neural function scores of rats in various groups(n=10，x±s）

2.2 各組大鼠學習記憶功能與假手術組比較，模型組大鼠尋找平臺時間增加（P<0.05）。與模型組比較，治療組大鼠尋找平臺時間減少（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠尋找平臺時間Tab. 2 Time of finding platform of rats in various groups(n=10，x±s）

2.3 各組大鼠血清和腦組織中HIF-1α 水平與假手術組比較，模型組大鼠血清和腦組織中HIF-1α水平均升高（P<0.05）。與模型組比較，治療組大鼠血清和腦組織中HIF-1α 水平均升高（P<0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清和腦組織中HIF-1α 水平Tab. 3 Levels of HIF-1α in serum and brain tissue of rats in various groups [n=10,x±s,ρB/（ng·L－1）]

2.4 各組大鼠腦組織中HIF-1α 和VEGFR2 蛋白表達水平與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中HIF-1α 和VEGFR2 蛋白表達水平均升高（P<0.05）。與模型組比較，治療組大鼠腦組織中HIF-1α 和VEGFR2 蛋白表達水平均升高（P<0.05）。見圖1 和表4。

圖1 Western blotting 法檢測各組大鼠腦組織中HIF-1α 和VEGFR2 蛋白表達電泳圖Fig. 1 Electrophoregram of expressions of HIF-1α and VEGFR2 proteins in brain tissue of rats in various groups detected by Western blotting method

表4 各組大鼠血腦組織中HIF-1α 和VEGFR2 蛋白表達水平Tab. 4 Expression levels of HIF-1α and VEGFR2 proteins in brain tissue of rats in various groups(n=3，x±s）

3 討 論

局灶性腦缺血是一種嚴重威脅人類生命和健康的疾病，其發病迅速且預后極差，可能會造成認知障礙或肢體痙攣等嚴重后果，在臨床治療過程中，頭部針刺療法安全可靠且無不良反應，在腦卒中的治療中具有良好的效果［9］。

HIF-1α 是受缺氧條件誘導的細胞因子，多在哺乳動物體內表達，隨著體內氧濃度變化而合成分泌。研究［10-11］顯示：缺氧狀態誘導生成的HIF-1α可通過促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）或血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF） 等促進血管生成， 并可影響Notch、Wnt 和Shh 等通路向機體組織供氧。研究［12］顯示：腦卒中患者在供氧量不足時，HIF-1α水平變化較為明顯，其與腦卒中的發展及患者預后有密切關聯。缺氧誘導HIF-1α 水平變化的具體機制尚未完全闡明。AMINOVA 等［13］認為：大鼠海馬細胞中HIF-1α 水平對于不同程度的刺激損傷表現出促進細胞活性和促進細胞凋亡的雙重作用。HIF-1α 水平升高可能反映腦組織損傷加重。研究［14］顯示：腦卒中大鼠模型中血腦屏障的通透性增加或發生腦水腫時，HIF-1α 水平升高。在頭部針刺治療腦卒中急性期患者，即使及時治療也存在部分癥狀繼續加重，表明在應激栓塞初期一段時間內，腦動脈細胞和神經的壞死會持續發生［15］。本研究結果顯示：造模后模型組大鼠血清和腦組織中HIF-1α 水平升高，而經過治療后，治療組大鼠腦組織中HIF-1α 水平繼續升高，與上述研究結論一致。HIF-1α 對腦組織損傷具有修復作用，研究［16-17］顯示：HIF-1α 抑制劑2-甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol，2ME2） 在降低腦缺血大鼠HIF-1α 水平的同時降低了神經元的存活率，表明HIF-1α 可調節神經元活性。BARANOVA 等［18］將小鼠神經元中HIF 基因特異性敲除，加重腦缺血模型中腦組織損傷，并降低細胞存活率。急性腦缺血通過HIF-1α 上調激活內源性組織型纖溶酶原激活物，從而破壞血腦屏障［19］。HIF-1α 水平升高可促進VEGF 表達升高， VEGF 主要通過作用于VEGFR2 促進血管內皮細胞的遷移并在缺氧缺血的區域增殖分化，進而發揮促進血管再生的功能。研究［20］顯示：HIF/VEGFR2 通路在局灶性腦缺血后血氧不足條件下表達增加，從而減少腦梗死面積和保護神經功能。HIF-1α 在N-乙酰半胱氨酸介導的神經保護中起重要作用，并為抗氧化劑在IS 的神經保護作用提供分子機制［21］。本研究結果顯示：造模后模型組和治療組大鼠腦組織中VEGFR2 蛋白表達水平均升高，HIF-1α 對血管內皮再生激活和腦組織損傷后修復起關鍵作用，而頭部針刺促進腦組織中HIF-1α 水平升高，增強腦組織損傷后的修復。

綜上所述，頭部針刺可能通過調控腦組織中HIF-1α 和VEGFR2 水平升高激活HIF/VEGFR2 血管再生通路，修復局灶性腦缺血大鼠腦組織功能，為進一步研究頭部針刺對局灶性腦缺血的血管內皮再生機制提供參考。