SOX17 過表達慢病毒載體和穩定轉染細胞系的構建

黃少婷, 李 友, 吳釗淳, 何嘉文, 廖科棋, 李勝男

（1. 廣東醫科大學 廣東省衰老相關心腦疾病重點實驗室， 廣東 湛江 524002；2. 廣東醫科大學附屬醫院神經病學研究所， 廣東 湛江 524002）

動脈粥樣硬化是臨床常見的心腦血管疾病，其病變基礎是脂質代謝障礙，可驅動脂質導致慢性炎癥性疾病的發生。顱內動脈粥樣硬化是全身動脈粥樣硬化的一部分。研究［16］表明：長鏈非編碼基因WDR59（long noncoding RNA WDR59，lncWDR59）表達可上調SOX17 表達，激活β-連接蛋白（β-catenin），減輕氧化修飾的低密度脂蛋白（oxidized-low density lipoprotein，ox-LDL）對內皮細胞的損傷。lncWDR59 可減輕敲除載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE） 小鼠動脈粥樣硬化和ox-LDL 誘導的內皮細胞DNA 損傷，促進內皮細胞增殖。本研究構建SOX17 過表達慢病毒載體并包裝為慢病毒，使用SOX17 過表達慢病毒感染PC12 細胞并構建穩定過表達SOX17 的細胞系，為探討SOX17 在顱內動脈粥樣硬化中的作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒、主要試劑和儀器大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12 細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司，人胚腎HEK 293T 細胞購自中國科學院上海細胞所。 慢病毒載體質粒GV492 （Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin）、輔助質粒Helper 1.0 和輔助質粒Helper 2.0 均由上海吉凱基因公司提供。 大腸桿菌菌株DH5α 購自北京Solarbio 公司，限制性核酸內切酶BamHⅠ和AgeⅠ購自美國NEB 公司，Taq 聚合酶購自北京SinoBio公司，一步法克隆試劑盒（含DNA 連接酶）購自美國Vazyme 公司，HS 聚合酶和反轉錄試劑盒購自北京Takara Bio 公司，Lipofectamine 2000 和TRIzol 試劑購自美國Invitrogen 公司，實時熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 染料預混液購自北京GenStar 公司，BCA 蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Scientific 公司，DMEM、RPMI-1640 和Opti-MEM 培養基購自美國Gibco 公司，膠回收試劑盒、50×TAE 和質粒抽提試劑盒由北京TIANGEN 公司提供，胰蛋白酶、瓊脂糖粉、酵母提取物和氯化鈉購自美國Vetec 公司，抗SOX17 抗體和抗GAPDH 抗體購自英國Abcam 公司，所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。倒置光學顯微鏡和倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司，RT-qPCR儀購自瑞士Roche 公司，電泳儀購自美國Bio-Rad公司，化學發光檢測儀購自美國Azure Biosystems公司。

1.2 細胞培養HEK 293T 細胞和PC12 細胞分別常規培養于含10% 胎牛血清和1% 青-鏈霉素DMEM 和RPMI-1640 培養基中， 置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，隔2~3 d 傳代1 次，細胞狀態良好及密度大于90%時采用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3 PCR 引物設計和合成NCBI 數據庫搜索SOX17（Gene ID：64321） 序列，結合引物設計原則和載體GV492 閱讀框克隆位點，設計引物。引物序列：SOX17 上游引物 5′-AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGAGCAGCCCGGA TGCGGGATAC-3′；SOX17 下游引物 5′-TCCTTGTAGTCCATACCGATGTCAGGGTAGTTGC AGTAGTAG-3′。設計并合成SOX17 PCR 鑒定引物： SOX17 上游引物5′-GCACATGGGCGCCCACTACC-3′； SOX17 下游引物 5′-CCTTATAGTCCTTATCATCGTC-3′。 設 計 并 合 成SOX17 RT-qPCR 引物：SOX17 上游引物5′-GTATAAGCCGGAGATGGGT-3′；SOX17 下游引物5′-CCGTCAGATGTCAGGGTAG-3′。 所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。將合成的基因引物通過PCR 擴增后得到DNA 片段，PCR 反應體系（50 μL）：10 μmol·L－1上、下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL，2.5 mmol·L－1dNTP 4 μL，5×酶緩沖液10 μ L，HS 聚合酶 0.5 μL，加ddH2O 至50 μL。PCR 反應條件：98 ℃變性5 min，98 ℃、10 s，55 ℃、10 s，72 ℃、90 s，30 個循環；72 ℃繼續延伸8 min，4 ℃保存。

1.4 SOX17 慢病毒載體構建采用BamH Ⅰ和AgeⅠ限制性內切酶對GV492 進行雙酶切，酶切體系（50 μL）：10×酶緩沖液 5 μL，1 g·L－1GV492 DNA 2 μL，BamH Ⅰ 1 μL，AgeⅠ 1 μL， 加ddH2O 至總體積為50 μL。吹打混勻離心后，置于37 ℃反應3 h 或過夜。采用酶切回收試劑盒初膠回收GV492 載體質粒。

采用一步法克隆試劑盒將PCR 擴增的SOX17產物連接至攜gcGFP/Puromycin 的慢病毒GV492載體，重組后載體見圖1。反應體系（10 μL）：5×酶緩沖液 2 μL，酶切后GV492 DNA 2.5 μL，純化后PCR 產物片段1 μL，DNA 連接酶 1 μL，加入ddH2O 至總體積為10 μL。該反應體系于冰水浴中配制，吹打混勻離心后，37 ℃反應30 min，冰浴冷卻5 min。

圖1 SOX17 過表達慢病毒載體構建圖Fig. 1 Diagram of construction of SOX17 over-expression lentiviral vector

將10 μL GV492 空載質粒和GV492-SOX17 過表達重組質粒分別加入至100 μL 感受態細胞DH5α中混勻，冰上反應30 min 后，42 ℃熱激1.5 min，冰浴2 min。加入500 μL LB 培養基，37 ℃搖床振蕩培養60 min。取適量培養后菌液，將其均勻涂布于含100 mg·L－1氨芐青霉素的LB 培養平板上，倒置平板于37 ℃恒溫培養箱中培養12~16 h。次日待平板上長出菌落，挑取適量菌落于3 mL 含100 mg·L－1氨芐青霉素的LB 培養基中，37 ℃搖床振蕩過夜，吸取適量菌液采用甘油保菌，剩余菌液進行PCR 和瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定體系（20 μL）：Taq 聚合酶 10 μL，10 μmol·L－1PCR上、下游引物各0.4 μL，適量甘油菌液，加入ddH2O 至總體積為20 μL。PCR 反應條件：94 ℃變性3 min，94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，22 個循環，72 ℃延伸5 min，于4 ℃保存。于基因片段長度為744 bp 附近出現目的條帶，提示該重組子為攜帶GV492-SOX17 過表達重組質粒的陽性菌。鑒定陽性菌經克隆后由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序成功的陽性菌通過質粒抽提試劑盒提取質粒，所得質粒即可用于后續實驗。

1.5 SOX17 慢病毒包裝和滴度測定轉染前1 d，將生長狀態良好的HEK 293T 細胞鋪至100 mm 細胞培養皿中，37 ℃、5%CO2培養箱中培養，細胞密度生長至80%~90% 時進行轉染。轉染體系：Mixture A，GV492 空載質?；騁V492-SOX17 過表達重組質粒 10 μ g， Helper 1.0 型 5 μg，Helper 2.0 型5 μg，Opti-MEM 750 μL；Mixture B，Lipofactamine 2000 15 μL，Opti-MEM 750 μL。分別混勻Mixtue A 和Mixtue B 體系，避光室溫靜置5 min，后將二者混勻，避光室溫孵育20 min。將Mixtue A 和Mixtue B 混合液加入至含3 mL Opti-MEM 的100 mm 培養皿中，37 ℃細胞培養箱內轉染4~6 h，后更換為正常生長培養基繼續培養48 h。熒光顯微鏡下觀察轉染效率約為90%時，收集培養皿上清液，采用0.45 μm 濾膜過濾，低溫超高速離心后棄上清液，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）溶解病毒沉淀。轉染GV492 空載質粒后收集的慢病毒為GV492 對照慢病毒，轉染GV492-SOX17 過表達重組質粒后收集的慢病毒即為GV492-SOX17 過表達慢病毒。

表2所示數據是在混合汽修正過程中截取的，發動機運行一段時間后，混合汽很快就修正到表1所示的數據。在筆者進行學習值清除后，混合汽長期修正值和短期修正值又都歸零，噴油時間變成了1ms，但氧傳感器λ值居然變成了0.6，此時發動機抖動加劇。但是，很快ECU又開始參與混合汽修正，短期修正值從0變成了-25%，同時噴油脈寬也變成了0.8ms，氧傳感器λ值變成了0.8，此時，雖然發動機仍然有些抖動，但比之前要平穩了許多。隨后，ECU繼續對混合汽進行修正，長期修正值也開始從0逐漸變成了-35%，噴油脈寬變為0.6ms，發動機運轉趨于基本平穩，此時調節過程已達到極限，氧傳感器λ值維持在0.99。

慢病毒滴度測定前1 d，將HEK 293T 細胞分為101μL 病毒溶液、100μL 病毒溶液和10－1μL 病毒溶液組，以每孔4×104個的細胞密度接種至96 孔細胞培養板中。棄培養基，各組分別加入相應濃度病毒溶液，37 ℃培養24 h 后，加入100 μL完全培養基，待4 d 后于熒光顯微鏡下觀察各組病毒熒光表達情況。

1.6 PC12 細胞感染和細胞系構建將PC12 細胞鋪于12 孔細胞培養板中，待細胞密度達到70%~80%時，按最佳感染復數100 取相應病毒量進行慢病毒感染實驗。將PC12 細胞分為將空白組、GV492 對照組和GV492-SOX17 組，空白組不作處理，GV492 對照組和GV492-SOX17 組分別采用GV492 對照慢病毒和GV492-SOX17 過表達慢病毒感染PC12 細胞，慢病毒感染24 h 后換液，繼續培養48 h，加入10 mg·L－1嘌呤霉素篩選，1 d 后換液，后維持嘌呤霉素濃度于5 mg·L－12 周。熒光顯微鏡下觀察，若PC12 細胞生長狀態良好且表達綠色熒光，則提示細胞系構建成功。

1.7 RT-qPCR 法檢測各組PC12 細胞中SOX17 mRNA 表達水平采用TRIzol 法提取各組RNA，逆轉錄合成cDNA，進行RT-qPCR 法檢測。反應體系（10 μL）：染料預混液5 μL，10 μmol·L－1PCR 上、下游引物各0.2 μL，cDNA 1 μL，加入ddH2O 至10 μL。PCR 擴增條件：95 ℃、10 s，55 ℃、20 s，72 ℃、15 s，共40 個循環，PCR 熔解條件：65 ℃、60 s，95 ℃、1 s。以GAPDH 為內參，采用2－△△Ct法計算目的基因表達水平。

1.8 Western blotting 法檢測各組PC12 細胞中SOX17 蛋白表達水平收集各組細胞，采用BCA蛋白定量法進行蛋白定量，恒壓60 V、30 min 和恒壓100 V、90 min 電泳，濕轉法轉模，快速封閉液封閉30 min，30 min 后TBST 緩沖液洗膜3 次，每次10 min。加入對應一抗，4 ℃孵育過夜，回收后洗膜3 次，室溫孵育二抗60 min，洗膜3 次，采用化學發光劑使條帶顯影。以GAPDH 為內參，采用Image J 軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1.9 統計學分析采用Graphpad Prism 6.0 統計軟件進行統計學分析。各組細胞中SOX17 mRNA和蛋白表達水平均符合正態分布，以xˉ±s 表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 SOX17 過表達慢病毒載體的鑒定結果GV492-SOX17 過表達重組質粒的基因片段長度約為744 bp，與預期一致。見圖2。將測序成功的GV492-SOX17 質粒DNA 序列與設計的SOX17序列比較，二者DNA 序列完全匹配，表明SOX17序列成功連接至GV492 載體中，PCR 產物鑒定和測序結果提示成功構建GV492-SOX17 慢病毒載體。見圖3。

圖2 GV492-SOX17 過表達重組質粒鑒定電泳圖Fig. 2 Electrophoregram of identification of GV492-SOX17 over-expression recombinant plasmids

2.2 SOX17 過表達慢病毒感染PC12 細胞鑒定結果細胞轉染48 h 后觀察可見熒光表達強烈，生長狀態良好，慢病毒包裝成功。GV492 對照慢病毒和GV492-SOX17 過表達慢病毒滴度均為2.5×108TU·mL－1。熒光顯微鏡下觀察結果顯示PC12細胞生長狀態良好且表達綠色熒光，表明穩定細胞系初步構建成功。見圖4。

圖4 熒光顯微鏡觀察慢病毒感染PC12 細胞中熒光表達情況（×4）Fig. 4 Expression of fluorescence in PC12 cells infected with lentivirus observed by fluorescence microscope(×4)

2.3 各組PC12 細胞中SOX17 mRNA 表達水平與空白組（1.174±0.124） 和GV492 對照組（2.635±0.370） 比較，GV492-SOX17 組PC12 細胞中SOX17 mRNA 表達水平（6.525±0.277） 明顯升高（P<0.01）。

2.4 各組PC12 細胞中SOX17 蛋白表達水平各組細胞在相對分子質量44 000 處出現特異性條帶，提示PC12 細胞中SOX17 蛋白成功表達。與空白組（1.000±0.065） 和 GV492 對照組 （1.571±0.088） 比較， GV492-SOX17 組PC12 細胞中SOX17 蛋白表達水平（2.078±0.140）升高（P<0.05）。見圖5。

圖5 各組PC12 細胞中SOX17 蛋白表達電泳圖Fig. 5 Electrophoregram of expression of SOX17 protein in PC12 cells in various groups

3 討 論

顱內動脈粥樣硬化是全身動脈粥樣硬化的一部分，可引起暫時性腦缺血發作、腦卒中和血管性癡呆等腦血管疾病。盡管不同部位的動脈粥樣硬化病變程度并不平行，但晚期顱內動脈粥樣硬化的病變程度與顱外動脈粥樣硬化的病變程度較為相似［17］。研究［18］顯示：電負性低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）可通過促進炎癥反應、誘導細胞凋亡、促進血栓形成和刺激LDL 顆粒的聚集融合等方式促進動脈粥樣硬化的發生發展。電負性LDL 由L1~L5 共分為5 個亞組分，其中L5 是帶負電最多的亞組分。研究［19］顯示：L5 對神經元樣PC12 細胞具有直接細胞毒性。此外，動脈粥樣硬化的發生發展還與Wnt/β-catenin 和Notch 信號通路炎癥反應相關通路的激活及內皮功能障礙有關［20-23］。

SOX17 可維持血管穩態，與Wnt/β-catenin 和Notch 信號通路存在調控關系。研究［7-8］顯示：SOX17 作為SOX 家族的一員，參與血管的發育。研究［8，12］顯示：SOX17 可通過Wnt/β-catenin 和Notch信號通路維持血管穩定性。NATARELLI等［16］研究顯示：lncWDR59 通過Notch1 介導的SOX17表達激活β-catenin。經ox-LDL 處理的主動脈內皮細胞中SOX17 的表達下調，但lncWDR59 可促進SOX17 的表達，促進Notch1 激活和增加β-catenin活性，通過減少細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2α調整細胞周期和修復DNA 損傷，減少微核DNA 損傷［16］。lncWDR59 可減輕ApoE 小鼠動脈粥樣硬化和ox-LDL 誘導的內皮細胞DNA 損傷，促進內皮細胞增殖［16］。提示SOX17 在顱內動脈粥樣硬化的形成過程中發揮重要作用。

PC12 細胞是具有神經細胞特性的細胞，生長繁殖速度快，被廣泛用于神經系統疾病研究。本研究結果顯示：GV492-SOX17 慢病毒表達載體成功構建，感染PC12 細胞后可在熒光顯微鏡下觀察到熒光表達，并證實PC12 細胞中SOX17 mRNA 和蛋白成功表達。

綜上所述，本研究成功構建了GV492-SOX17慢病毒表達載體， 建立了穩定過表達GV492-SOX17 的PC12 細胞， 為進一步探討SOX17 在顱內動脈粥樣硬化中的作用機制提供參考。