局部脈沖振動刺激對兔前交叉韌帶重建后本體感覺恢復的影響

張新強, 王 博, 馮會成

（1. 解放軍總醫院第八醫學中心骨科，北京 100091；2. 河北北方學院研究生學院外科，河北 張家口 075051）

前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）的主要功能是阻止脛骨前移，并為膝關節提供前向和旋轉穩定性。ACL 斷裂常見于年輕人和體育愛好者，主要由非接觸性減速、跳躍或剪切運動造成損傷，出現患側膝關節不穩和疼痛等癥狀，對患者日常生活及運動造成嚴重影響。ACL 斷裂后行ACL 重建（ACL reconstruction，ACLR） 是治療的首選，ACLR 可提供良好的膝關節穩定性［1］。ACL 損傷的患者如不進行有效處理，其患膝骨性關節炎的可能性是健康者的3~5 倍［2］。盡管ACL的結構可以從根本上重建，但部分患者術后早期感覺膝關節不穩定，這是由于重建的ACL 本體感覺并未恢復［3］。劉曉磊等［4］研究顯示：ACL 損傷患者ACLR 術后雙下肢的本體感覺和姿勢控制能力均降低。ACL 損傷患者術前本體感覺喪失，ACLR術后以本體感覺訓練為主的康復方案對膝關節本體感覺和功能狀態有顯著改善效果［5］。ACLR 術后有效的康復訓練對于ACL 損傷患者較為重要，ACLR 術后康復可促進患者的活動水平和膝關節功能恢復至受傷前［6］。張曉宇等［7］發現：ACLR 術后進行早期康復對膝關節功能恢復可能存在優勢。陳鵬等［8］認為：全身振動訓練可以改善ACLR 術后患者的本體感覺和平衡。目前尚未完全闡明ACLR 術后患者振動刺激治療的振幅強度、振動頻率和作用時間的統一標準。本研究構建ACL 損傷兔模型，使用不同振幅強度、振動頻率和作用時間對其進行振動刺激治療，探討不同局部脈沖振動刺激治療條件對ACLR 術后本體感覺恢復的影響，為臨床實踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器選取健康新西蘭大白兔45 只，雌雄不限，體質量2.0~2.5 kg，動物生產合格證號：SCXK（京）2016-0003，由北京市海淀區興隆實驗動物養殖廠提供，動物使用許可證號：SYXK（軍）2012-0016。鼠抗兔 S-100 單克隆抗體、 多聚體抗小鼠免疫球蛋白 G（immunoglobulin G， IgG） - 辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）試劑盒、內源性過氧化物酶阻斷劑、4%多聚甲醛和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）購自武漢博士德生物工程有限公司，HE 染色液購自珠海貝索生物技術有限公司。切片機、脫水機和包埋機購自武漢俊杰電子有限公司，顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，掃描儀購自德國Leica 公司，多功能酶標儀購自美國BioTek 公司，PCR 儀購自美國Applied Biosystems 公司。

1.2 實驗動物造模和分組按參照文獻［9］的方法，選取15 只兔用于提供同種異體移植肌腱的制備。兔麻醉成功后，將其仰臥位固定于實驗臺，嚴格遵守無菌操作，將兔雙側趾長伸肌腱切下，進行脫細胞去除免疫源性后，置于深低溫冰箱中逐步降溫至－80 ℃保存備用。2 周后將制備好并儲存于－80 ℃冰箱中的同種異體移植肌腱解凍，將取出的肌腱置于40 ℃、生理鹽水注射液中融化15 min，當肌腱恢復彈性后，置于40 000 U·100 mL－1慶大霉素注射液漂洗5~10 min，再經生理鹽水注射液沖洗，肌腱兩端分別采用不吸收線編制縫合后，置入生理鹽水注射液中備用。

選取30 只兔右膝關節制備ACL 模型，左膝關節不做處理。兔麻醉成功后，膝關節術區備皮消毒鋪無菌單，切開膝關節，顯露ACL，于韌帶上、下止點處切斷ACL，分別于脛骨和股骨ACL 附著處鉆骨隧道。將同種異體肌腱移植物穿過骨道，于屈膝45°狀態下拉緊肌腱移植物，兩端縫線固定，查前抽屜實驗和Lachman 實驗陰性后，重建韌帶有效，固定牢靠，縫合切口，敷料包扎。術后每只兔均以單獨兔籠喂養，術前和術后每只兔注射抗生素預防感染，切口換藥，術后10 d 所有兔傷口均愈合，未發生切口感染或延遲愈合等情況。術后將30 只兔隨機分為對照組和9 個振動刺激治療組（振動刺激治療1~9 組），每組3 只。對照組兔常規喂養，振動刺激治療組兔于術后10 d 開始行局部脈沖振動刺激治療，將局部脈沖振動刺激裝置置于兔膝部進行治療，每2 d 治療1 次，共治療12 周。

1.3 正交實驗設計振動刺激治療參數采用“三因素三水平”正交實驗設計振動刺激治療參數，將振幅強度（A）、振動頻率（B） 和作用時間（C）作為治療因素，每個因素設定3 個水平，分別為振幅強度：2、3和4 mm，振動頻率：25、35 和45 Hz，作用時間：10、20和30 min。振動刺激治療1~9 組依據振動刺激治療參數劃分，振動刺激治療1 組參數為振幅強度4 mm（賦值為3）、振動頻率35 Hz（賦值為2）和作用時間30 min（賦值為3），振動刺激參數代碼：A3B2C3，振動刺激治療2~8 組進行參數賦值。見表1 和2。

表1 正交實驗設計治療因素和水平Tab.1 Treatment factors and levels designed by orthogonal experiment

表2 正交實驗設計振動刺激治療參數Tab.2 Vibratory stimulation treatment parameters designed by orthogonal experiment

1.4 ACL 樣本采集和處理干預治療12 周后將30 只兔采用空氣栓塞法處死，快速暴露并取材ACL，將切取的1/2 韌帶組織置于4%多聚甲醛固定24 h。將另外1/2 韌帶采用無RNA 酶的生理鹽水洗滌，置入5 mL 凍存管并快速投入液氮中，再放入－80 ℃冰箱中保存備用。

1.5 HE 染色觀察各組兔ACL 本體感受器形態表現更換容器中4%多聚甲醛，浸泡2 h。PBS 緩沖液浸泡清洗15 min，3 次。二甲苯脫水透明，石蠟浸蠟，包埋機包埋。冷凍臺放置10 min 后取下蠟塊。采用切片機切片，厚度為3 μm。石蠟切片脫蠟至水，烘干，蘇木素和伊紅染色，100%酒精脫水2 s，烘干后中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察各組兔ACL 本體感受器形態表現并拍照。

1.6 S100 免疫組織化學染色觀察各組兔ACL 本體感受器分型兔ACL 樣本切片常規脫蠟至水。將內源性過氧化物酶阻斷劑滴加于組織上，室溫孵育10 min，雙蒸水清洗滅活。滴加 5% BSA 封閉液，37 ℃孵育30 min。甩去多余液體，不洗滌。一抗孵育4 ℃過夜。取出后 37 ℃復溫30 min，PBS 緩沖液洗滌3 次，每次5 min。滴加聚合 HRP 抗兔/小鼠IgG，37 ℃孵育30 min。PBS 緩沖液洗滌3 次，每次5 min。滴加DAB 顯色液顯色，顯微鏡下觀察并控制反應時間。水洗后復染，滴加蘇木素， 室溫孵育1 min，PBS 緩沖液清洗，堿性溶液返藍，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 計數各組兔ACL 本體感受器細胞數采用參考文獻［10］中ACL 本體感受器分型方法，光學微鏡下觀察各組兔ACL 本體感受器HE 染色切片和S100 免疫組織化學染色切片，于ACL 脛骨和股骨端分別取2 張切片，中間取1 張切片，分別記錄S100 免疫組織化學染色切片中類Ruffini 小體數、類Pacinian 小體數和類Golgi 腱器官數，計算各組兔ACL 本體感受器細胞數。由3 名相關專業知識人員經過培訓后進行計數，取平均值。ACL 本體感受器細胞數=類Ruffini 小體數+類Pacinian 小體數+類Golgi 腱器官數。

1.8 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法檢測各組兔ACL 組織中生長相關蛋白43（growth associated protein-43，GAP-43）mRNA 表達水平提取各組兔ACL 組織中總RNA，反轉錄為cDNA 后進行RT-qPCR 法檢測。引物序列見表3。反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，63 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，共40 個循環。以GAPDH 為內參，采用2－△△Ct法計算各組兔ACL 組織中GAP-43 mRNA 表達水平。

表3 PCR 引物序列Tab.3 Primer sequences of PCR

1.9 正交分析法篩選ACLR 術后康復振動刺激治療最優參數計算振動刺激治療1~9 組兔ACL 本體感受器細胞數和GAP-43 mRNA 表達水平的平均值，建立正交分析表，計算K 值和R 值，判定振幅強度、振動頻率和作用時間3 個影響因素的順序和相應因素的最優參數。K 值為相應因素三水平對應的各組兔ACL 本體感受器細胞數和GAP43 mRNA表達水平的平均值，R 值為相應因素中K 值的極差。K1：振幅強度2 mm、振動頻率25 Hz 和作用時間10 min；K2：振幅強度3 mm、振動頻率35 Hz 和作用時間20 min；K3：振幅強度4 mm、振動頻率45 Hz 和作用時間30 min。同組中K 值越大，相應參數下該指標的治療效果越好；R 值越大，相應因素對該指標的影響越大。根據無空白列有重復正交實驗進行方差分析，F 值越大，則相應因素對實驗結果的影響越大。

1.10 統計學分析采用 SPSS 26.0 統計軟件進行統計學分析。各組兔ACL 本體感受器細胞數和ACL 組織中GAP-43 mRNA 表達水平均呈正態分布，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 ACL 模型鑒定兔模型中可見移植物張力尚可，無松弛狀態，前抽屜實驗和Lachman 實驗結果均為陰性。治療后取ACL 組織，可見移植物連續性存在，與脛骨和股骨腱骨愈合。見圖1 和2。

圖1 移植的ACL 組織Fig. 1 Transplanted ACL tissue

圖2 移植后ACL 組織愈合情況Fig. 2 Healing of ACL tissue after transplantation

2.2 各組兔ACL 本體感受器形態表現和分型ACL 本體感受器中可見Ruffini 小體為卵圓形或樹突狀形態，直徑25~330 μm；Pacinian 小體為圓形或橢圓形感受器，直徑40~220 μm；Golgi 腱器官感受器呈梭形，直徑140~900 μm；游離神經末梢為無髓鞘神經末梢，長度0.5~1.5 μm。移植ACL中本體感受器主要分布于ACL 的脛骨和股骨附著點，主要為類Ruffini 小體和類Pacinian 小體，無典型的類Golgi 腱器官。見圖3 和4。

圖3 兔正常ACL 中本體感受器（HE，×200）Fig. 3 Proprioceptors in normal ACL of rabbits (HE,×200)

圖4 各組兔ACL 本體感受器分型（S100 免疫組織化學，×400）Fig. 4 ACL proprioceptor types of rabbits in various groups (S100 immunohistochemstry,×400)

2.3 各組兔ACL 本體感受器細胞數與對照組比較，振動刺激治療3、振動刺激治療5 和振動刺激治療7 組兔ACL 本體感受器細胞數明顯增加（F=28.49，P<0.01）。見表4。

表4 各組兔ACL 本體感受器細胞數Tab. 4 Number of ACL proprioceptor cells of rabbits in various groups(n=3，±s）

表4 各組兔ACL 本體感受器細胞數Tab. 4 Number of ACL proprioceptor cells of rabbits in various groups(n=3，±s）

*P<0.01 compared with control group.

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2.4 各組兔ACL 組織中GAP-43 mRNA 表達水平各組兔ACL 組織中GAP-43 mRNA 表達水平比較差異無統計學意義（F=0.83，P>0.05）。見表5。

表5 各組大白兔ACL 組織中GAP- 43 mRNA 表達水平Tab. 5 Expression levels of GAP- 43 mRNA in ACL tissue of rabbits in various groups(n=3，±s）

表5 各組大白兔ACL 組織中GAP- 43 mRNA 表達水平Tab. 5 Expression levels of GAP- 43 mRNA in ACL tissue of rabbits in various groups(n=3，±s）

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2.5 不同振動刺激參數下兔ACL 本體感受器數振幅強度、振動頻率和作用時間對局部脈沖振動刺激治療ACLR 術后本體感受器數均存在較大影響，影響程度（以F值計）為振幅強度>作用時間>振動頻率。不同振幅強度治療條件下，ACL 本體感受器細胞數排序為3 mm>2 mm>4 mm，最優振幅強度為3 mm；不同振動頻率治療條件下，ACL本體感受器細胞數排序為25 Hz>35 Hz>45 Hz，最優振動頻率為25 Hz；不同作用時間下，ACL 本體感受器細胞數排序為10 min>30 min>20 min，最佳作用時間為10 min。見表6 和7。

表6 ACL 本體感受器細胞數方差分析Tab.6 Variance analysis on number of ACL proprioceptor cells

表7 不同振動刺激參數下ACL 本體感受器細胞數正交分析Tab.7 Orthogonal analysis on number of ACL proprioceptor cells under different vibratory stimulation parameters

2.6 不同振動刺激參數下兔ACL 組織中GAP-43 mRNA 表達水平振幅強度、振動頻率和作用時間對局部脈沖振動刺激治療ACLR 術后兔ACL 組織中GAP-43 mRNA表達水平均無明顯影響（以F值計）。2、3 和4 mm 振幅強度作用后，ACLR 術后兔ACL 組織中GAP-43 mRNA 表達水平無明顯變化；25、35 和45 Hz 振動頻率作用后，ACLR 術后兔ACL 組織中GAP-43 mRNA 表達水平無明顯變化；作用10、20 和30 min 后，ACLR 術后兔ACL組織中GAP-43 mRNA 表達水平無明顯變化。見表8 和9。

表8 兔ACL 組織中GAP- 43 mRNA 表達水平方差分析Tab.8 ANOVA on expression levels of GAP- 43 mRNA in ACL tissue of rabbits

表9 不同振動刺激參數下兔ACL 組織中GAP- 43 mRNA表達水平正交分析Tab. 9 Orthogonal analysis on expression levels of GAP- 43 mRNA in ACL tissue of rabbits under different vibration stimulation parameters

3 討 論

ACL 中包括Ruffini 小體、 Pacinian 小體、Golgi 腱器官和游離神經末梢等重要的膝關節本體感覺結構［11］。其主要位于韌帶的脛骨和股骨附著點，分別參與意識靜態狀態下關節位置覺、檢測關節運動/加速度和調節反射性肌肉收縮，向中樞神經系統提供有膝關節位置和運動及力和力的感覺傳入反饋［12-14］。振動刺激治療是ACLR 術后康復的重要部分，可激活本體感覺發生反射，使肌肉受到振動刺激后不自主收縮進而得到迅速康復。

研究［15］顯示：振動可刺激人體多個生物系統，可引起包括皮膚感受器、關節本體感受器、前庭系統變化和神經遞質和激素濃度變化。研究［16］顯示：低振幅機械噪聲振動刺激治療對ACLR 術后患者的本體感覺恢復有積極作用，可提高本體感覺敏銳度。本研究結果顯示：合適條件下的局部脈沖振動刺激治療可明顯增加模型兔的本體感受器細胞數，提示局部脈沖振動刺激治療可促進ACLR 術后兔本體感覺恢復，達到加快兔ACLR 術后康復的目的。

振動刺激治療可改善ACLR 術后患者的本體感覺恢復，但振動刺激參數與治療效果的關系尚未完全闡明。研究［17］顯示：振動頻率在26~44 Hz 時可提高肌肉力量，振動頻率<20 Hz 僅引起肌肉放松，>50 Hz 將引起肌肉損傷。HAN 等［18］發現：在20 Hz 振動頻率下ACL 感受器細胞的增殖活性較對照組升高20%。本研究結果顯示：局部脈沖振動刺激治療最主要的影響參數是振幅強度，而振幅強度為3 mm、振動頻率為25 Hz 和作用時間為10 min 是ACL 本體感受器細胞增殖的最優參數。因此，臨床上對ACLR 術后患者行局部脈沖振動刺激治療時，可以通過降低振幅強度、降低振動頻率和縮短治療時間以提高治療效果。

GAP-43 是一種神經系統特異性生長相關蛋白，在神經發育和再生過程中表達。研究［19］顯示：當ACL 損傷時，本體感受器中GAP-43 被激活，GAP-43 表達水平升高。本研究結果顯示：振幅強度、振動頻率和作用時間對局部脈沖振動刺激治療ACLR 術后ACL 組織中GAP-43 mRNA 表達水平均無明顯影響，考慮為本研究實驗持續時間較短，需行進一步實驗證實。

綜上所述，局部脈沖振動刺激治療可促進兔ACLR 術后ACL 本體感受器恢復。振幅強度、振動頻率和作用時間是局部脈沖振動刺激治療ACLR術后本體感覺恢復的影響因素，其中振幅強度是最主要的影響因素?？刹捎玫驼穹?、低振動頻率和短時間的局部脈沖振動刺激治療加快ACLR 術后兔本體感覺恢復。