川芎嗪對膠質瘤干細胞裸鼠皮下移植瘤生長、TGF-β 信號通路和上皮-間質轉化的影響

何 濤, 李振江, 丁炳謙

（河南大學淮河醫院神經外科, 河南 開封 475000）

膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM） 是最常見的原發性顱內腫瘤，具有侵襲性。采用放療和替莫唑胺標準治療的GBM 患者中位總生存期僅為15.6 個月，預后極差［1］。膠質瘤干細胞 （glioma stem cells，GSCs）是一種以自我更新和致瘤性為特征的罕見亞群，又稱腫瘤起始細胞，GSCs 的增殖與對藥物、輻射和細胞應激的抵抗力增強有關，被認為是GBM 患者腫瘤復發和治療抵抗的根本原因［2-3］。研究［4］顯示：GSCs 可分化為間充質亞型，上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT） 與該過程有關。 轉化生長因子 β（transforming growth factor-β， TGF-β） 是參與EMT 的關鍵細胞因子，研究［5］顯示：TGF-β1 可在腫瘤進展和轉移過程中誘導EMT 并增強GSCs干性，提示其可作為膠質瘤臨床治療的分子靶點。川芎嗪是中草藥川芎的生物堿成分，主要應用于缺血性心血管疾病中。研究［6］顯示：川芎嗪可抑制三陰乳腺癌的增殖、侵襲和EMT，對卵巢癌和腎透明細胞癌的惡性表型也具有積極的干預作用［7-8］。本研究探討川芎嗪調控TGF-β 信號通路介導GSCs惡性進展，構建GSCs 荷瘤裸鼠模型，給予不同劑量川芎嗪進行干預，觀察藥物對腫瘤進展的影響，以期為膠質瘤臨床治療藥物的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞、主要試劑和儀器40 只雌性BALB/c 裸鼠，4 周齡，體質量（18±3）g，購自四川省人民醫院實驗動物研究所，實驗動物生產許可證號：SCXK（川） 2018-15。裸鼠飼養于溫度（24±2）℃、相對濕度50%~60%環境下，自由飲食，12 h 光-暗交替，適應性飼養1 周，本研究符合一般動物實驗倫理學原則。人腦膠質瘤細胞系U87細胞購自美國ATCC細胞庫。表皮生長因子（100-15）和堿性成纖維細胞生長因子（100-18B）購自美國Peprotech 公司，B-27 補充劑（17504-044）購自美國 Invitrogen 公司， 川芎嗪 （ 純度≥98%）（DC0032）購自成都德思特生物技術有限公司，母親 DPP 同 源 物 2/3 （small mother against decapentaplegic homolog 2/3，Smad2/3）（ABP52462）購自武漢艾美捷生物科技有限公司，TGF-β1 （YT763） 和 磷 酸 化 Smad2/3（phosphorylated Smad2/3，p-Smad2/3）（K25210）抗體購自北京百奧萊博生物科技有限公司，TGF-β受體Ⅰ（TGF-β receptor Ⅰ，TβRⅠ）（ENT4627）抗體購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，TWIST 家族bHLH 轉錄因子1 （TWIST family bHLH transcription factor 1，TWIST1）（abs131127）抗體購自上海愛必信生物科技有限公司，波形蛋白（Vimentin）（bs-8533R） 抗體購自北京博奧森生物科技有限公司，E-鈣黏蛋白（E-cadherin）（ab181296） 和鋅指蛋白（Snail）（ab216347） 抗體購自美國Abcam 公司。7500HT型實時熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 儀購自美國ABI 公司，550 型全自動酶標儀、PowerPac 電泳儀和CheniDoc XRS 化學發光成像分析系統購自美國Bio-Rad 公司。

1.2 GSCs 分離、富集和免疫熒光鑒定接種U87細胞至含10% 胎牛血清和1% 青-鏈霉素的DMEM/F12 培養液中，于37 ℃、5% CO2的加濕培養箱內培養24 h。后將培養液更換為無血清神經干細胞DMEM/F12 培養液（含1%青-鏈霉素、40 μg·L－1人表皮生長因子、40 μg·L－1人成纖維細胞生長因子和體積分數為2%的B-27 補充劑）。具有自我更新能力的GSCs 形成腫瘤球，分離并消化腫瘤球為單細胞懸液，高密度接種至6 孔細胞培養板中繼續培養以富集GSCs。取富集后的GSCs，于4%多聚甲醛中固定30 min，Triton X-100 透核膜15 min， 5% 牛血清白蛋白封閉2 h， 4 ℃CD133 一抗（1∶400）內孵育過夜，室溫下熒光二抗避光孵育1 h，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚染核10 min，光學顯微鏡下觀察細胞形態表現，熒光顯微鏡下檢測干細胞標志物CD133 的表達并拍照。

1.3 裸鼠皮下移植瘤制備和實驗分組經鑒定所富集細胞為GSCs。取對數生長期GSCs 并將其密度調整為1×104L－1，統一于裸鼠頸背部皮下接種200 μL 單細胞懸液，待皮下出現圓形結節，卡尺測量腫瘤直徑，當腫瘤直徑約為1 cm 時開始治療試驗。將GSCs 皮下移植瘤裸鼠隨機分為模型組和低、中及高劑量川芎嗪組，每組10 只。其中模型組裸鼠僅給予等量生理鹽水，低、中和高劑量川芎嗪組裸鼠分別腹腔注射川芎嗪1.5、 3.0 和6.0 mg·kg－1，每3 d 給藥1 次，連續15 d。

1.4 測量各組裸鼠移植瘤體積、稱瘤質量及計算瘤質量抑制率開始給藥后，于第1、4、8、12 和15 天測量移植瘤體積，繪制移植瘤體積變化曲線。末次給藥3 d 后，頸椎脫臼處死各組裸鼠并解剖剝離瘤體，清理并擦拭表面液體后稱瘤質量并計算瘤質量抑制率。移植瘤體積（cm3） =1/2× 最長徑（cm）×最短徑（cm）2。瘤質量抑制率=［模型組平均瘤質量（mg）－給藥組平均瘤質量（mg）］/模型組平均瘤質量（mg）×100%。

1.5 HE 染色觀察各組裸鼠腫瘤組織病理形態表現取各組裸鼠部分腫瘤組織保存于4%多聚甲醛固定過夜，制備4 μm 厚度石蠟切片，按照HE 染色試劑盒說明書進行染色，光鏡下觀察各組裸鼠腫瘤組織病理形態表現并采集圖片。

1.6 RT-qPCR 法檢測各組裸鼠腫瘤組織中TGF-β1和TβRⅠmRNA 表達水平取各組裸鼠腫瘤組織提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性并將其反轉錄為cDNA。制備RT-qPCR 反應體系，于RT-qPCR 儀內進行定量檢測，熱循環條件：50°C、2 min，95 ℃、10 min，95℃、15 s，60 ℃、1 min，共40個循環。引物序列：TGF-β1 上游引物5′-GGATACCAACTATTGCTTCAGCTCC-3′，TGF- β1 下游引物5′-AGGCTCCAAATATAGGGGCAGGGTC-3′； TβR Ⅰ上游引物5′-GGCCAAATATCCCAAACAGAT-3′，TβR Ⅰ下游引物5′-AATCCAACTCCTTTGCCCTTA-3′； β -actin上游引物5′-AGCGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，β-actin 下游引物5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′。以β-actin 為內參，采用2－ΔΔCt法計算各組裸鼠腫瘤組織中TGF-β1 和TβRⅠ mRNA 表達水平。

1.7 Western blotting 法檢測各組裸鼠腫瘤組織中相關蛋白表達水平取各組裸鼠腫瘤組織提取全蛋白，BCA 蛋白質測定試劑盒測定蛋白濃度，加熱變性。于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離等量蛋白質，并轉移至聚偏二氟乙烯膜上，含5% 脫脂奶粉的TBST 緩沖液中37 ℃封閉2 h，Vimentin、E-cadherin、Snail、TWIST1、TGF-β1、TβRⅠ、Smad2/3、p-Smad2/3 蛋白和β-actin 一抗（均以1∶1 000 稀釋）4 ℃孵育過夜，洗膜，辣根過氧化物酶偶聯的二抗（1∶10 000 稀釋）室溫孵育2 h，洗膜，ECL Plus 發光試劑顯影，凝膠成像系統成像并記錄，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1.8 統計學分析采用SPSS 26.0 統計軟件進行統計學分析， Graphpad prism9.5.1 軟件繪制腫瘤體積變化曲線。各組GSCs 裸鼠皮下移植瘤體積、瘤質量和瘤質量抑制率，移植瘤組織中TGF-β1 和TβRⅠ mRNA 表達水平及相關蛋白表達水平均符合正態分布，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 GSCs 免疫熒光鑒定U87 細胞在有血清的DMEM/F12 培養基中貼壁生長，經無血清神經干細胞培養液培養后，可見GSCs 球體非貼壁呈懸浮樣生長，經富集培養后，細胞球體明顯增大。免疫熒光染色可見干細胞標志物CD133 陽性表達。提示分離和富集的細胞為GSCs，且具有成瘤能力，可用于后續試驗。見圖1 和2。

圖1 光學顯微鏡下觀察U87 細胞（A）和GSCs（B）形態表現（×100）Fig. 1 Morphology of U87 cells(A)and GSCs(B) observed by optical microscope(×100）

圖2 免疫熒光鑒定GSCs 中CD133 表達（×200）Fig. 2 Expression of CD133 in GSCs identified by immunofluorescence (×200）

2.2 各組裸鼠移植瘤體積變化與模型組比較，低、中和高劑量川芎嗪組裸鼠皮下移植瘤體積均減?。≒<0.05），且呈劑量依賴性。見圖3。

圖3 各組裸鼠移植瘤生長曲線Fig. 3 Growth curves of transplanted tumors of nude mice in various groups

2.3 各組裸鼠移植瘤質量和瘤質量抑制率與模型組比較，低、中和高劑量川芎嗪組裸鼠移植瘤瘤質量均降低（P<0.05），且呈劑量依賴性。低、中和高劑量川芎嗪組瘤質量抑制率逐漸增大（P<0.05），分別為12.72%、 39.90% 和55.36%。見圖4 和表1。

表1 各組裸鼠瘤質量和瘤質量抑制率Tab. 1 Tumor weights and inhibitory rates of tumor weights of nude mice in various groups(n=10）

圖4 各組裸鼠移植瘤大體形態Fig. 4 Gross morphology of transplanted tumor of nude mice in various groups

2.4 各組裸鼠移植瘤組織病理形態表現模型組裸鼠腫瘤組織細胞形態良好，連接緊密，生長密度高，核異型性明顯；低、中和高劑量川芎嗪組裸鼠腫瘤組織結構紊亂，細胞密度逐漸降低，核固縮和核裂解逐漸明顯，組織壞死區逐漸增大，且隨著川芎嗪劑量的增加，上述改善逐漸明顯。見圖5。

圖5 各組裸鼠移植瘤組織病理形態表現（HE,×200）Fig. 5 Pathomorphology of transplanted tumor tissue of nude mice in various groups (HE,×200)

2.5 各組裸鼠移植瘤組織中TGF-β1 和TβRⅠmRNA 表達水平與模型組比較，低、中和高劑量川芎嗪組裸鼠移植瘤組織中TGF-β1 和TβRⅠmRNA 表達水平均降低（P<0.05），且呈劑量依賴性。見表2。

表2 各組裸鼠移植瘤組織中TGF-β1 和TβRⅠ mRNA 表達水平Tab. 2 Expression levels of TGF-β1 and TβR Ⅰ mRNA in transplanted tumor tissue of nude mice in various groups(n=10，x±s）

2.6 各組裸鼠移植瘤組織中 E-cadherin、Vimentin、Snail 和TWIST1 蛋白表達水平與模型組比較，低、中和高劑量川芎嗪組裸鼠皮下移植瘤組織中E-cadherin 蛋白表達水平均升高（P<0.05），TWIST1、Vimentin 和Snail 蛋白表達水平均降低（P<0.05），且呈劑量依賴性。見圖6和表3。

表3 各組裸鼠移植瘤組織中EMT 相關蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of EMT-related proteins in transplanted tumor tissue of nude mice in various groups (n=10，x±s）

圖6 Western blotting 法檢測各組裸鼠移植瘤組織中EMT 相關蛋白表達電泳圖Fig. 6 Electrophoregram of expressions of EMTrelated proteins in tumor tissue of nude mice in various groups detected by Western blotting method

2.7 各組裸鼠移植瘤組織中TGF-β1、TβRⅠ、Smad2/3 和p-Smad2/3 蛋白表達水平與模型組比較，低、中和高劑量川芎嗪組裸鼠移植瘤組織中TGF-β1、TβRⅠ和p-Smad2/3 蛋白表達水平均降低（P<0.05），且呈劑量依賴性。各組裸鼠移植瘤組織中Smad2/3 蛋白表達水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖7 和表4。

表4 各組裸鼠移植瘤組織中TGF-β 信號通路蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of TGF-β signaling pathway proteins in transplanted tumor tissue of nude mice in various groups(n=10，x±s）

圖7 Western blotting 法檢測各組裸鼠移植瘤組織中TGF-β 信號通路蛋白表達電泳圖Fig. 7 Electrophoregram of expressions of TGF-β signaling pathway proteins in tumor tissue of nude mice in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

WHO 根據膠質瘤的病理類型分為4 個等級，其中Ⅰ級和Ⅱ級為低級別膠質瘤，Ⅲ級和Ⅳ級為高級別膠質瘤，GBM 為Ⅳ級膠質瘤，傾向于在復發時將GBM 亞型由原神經型轉化為間充質型，間充質型GBM 最具侵襲性和穩定性［9］。在EMT 激活的腫瘤轉移過程中，部分GBM 細胞表現出類似于干細胞的自我更新能力，提示調控GSCs 中EMT進展可作為臨床開發新的治療策略靶點［10］。

研究［11］顯示：無血清培養基可促進GSCs 由GBM 中分離并保持干性特征，并可通過干細胞表面標志物表達、球體形成和異體移植等方法鑒定。CD133 是應用于GSCs 分離最常見的標志，與腫瘤血管生成和細胞增殖有關，CD133 陰性GSCs 缺乏自我更新和體外形成球體的能力［12］。本研究結果顯示：經無血清神經干細胞培養液培養后，貼壁生長的U87 細胞中可見懸浮球體樣細胞團，經分離和富集后，球體細胞團增殖明顯，經免疫熒光鑒定后，所得細胞CD133 陽性表達，且在異種移植后可形成瘤組織，提示本研究所分離和富集的細胞為GSCs，且具有成瘤能力，可用于后續試驗。近年來，有研究［13-14］評估了傳統藥物作為癌癥替代療法的效果，發現川芎嗪除具有抗炎、抗纖維化和抗氧化活性外，還具有顯著的抑癌活性。DONG 等［15］發現：川芎嗪可干擾肺癌細胞增殖和侵襲，并可抑制體內腫瘤形成。CHEN 等［16］研究顯示：川芎嗪可明顯降低裸鼠體內結腸腫瘤質量。本研究構建GSCs 裸鼠皮下移植瘤模型，并給予不同劑量川芎嗪治療后發現，給藥組裸鼠皮下移植瘤體積和瘤質量明顯降低，同時低、中和高劑量川芎嗪組瘤質量抑制率逐漸升高，提示川芎嗪可呈劑量依賴性抑制GSCs 裸鼠移植瘤生長。這可能與川芎嗪可誘導腫瘤細胞發生病理損傷并破壞腫瘤組織結構從而導致移植瘤生長受限有關，同時表明川芎嗪具有作為新型抗膠質瘤藥物的潛力。

EMT 為細胞遷移、侵襲和轉移的先決條件，其生物學特性主要包括促進腫瘤細胞惡性增殖、減少細胞凋亡、衰老及促進免疫抑制等，目前已被廣泛報道為促進膠質瘤遷移、侵襲和腫瘤進展的關鍵機制［17］。TWIST1、Snail 和Slug 等蛋白為EMT誘導轉錄因子，可通過不同的信號級聯直接或間接參與癌癥細胞轉移，上述因子過表達時可促進EMT，最終將導致E-cadherin 表達下調，轉移蛋白如Vimentin、N-鈣黏蛋白和基質金屬蛋白酶-2 表達上調［18］。研究［19-20］顯示：Snail 可促進胚胎或上皮源性腫瘤中的EMT，在GBM 中，Snail 促進腫瘤入侵，通過下調TWIST1 和Snail 表達可抑制GSCs 中EMT 程序的激活，進而抑制GSCs 在腦組織中的彌漫性浸潤。E-cadherin 是一種跨膜糖蛋白，在正常細胞中發揮抑制腫瘤的作用，其表達和細胞極性的喪失是EMT 的關鍵步驟，E-cadherin 表達下調通常表明各種癌癥患者的預后和存活率較差。與EMT 期間E-cadherin 功能喪失比較，Vimentin和N-鈣黏蛋白作為間充質標志物表達上調，可促進細胞遷移或轉移至靶器官［2］。本研究結果顯示：與模型組比較，川芎嗪可有效降低GSCs 腫瘤組織中TWIST1、Snail 和Vimentin 蛋白表達水平，升高E-cadherin 蛋白表達水平，提示川芎嗪可能通過抑制GSCs 中EMT 誘導而抑制癌細胞向間充質亞型轉化，進而發揮對腫瘤惡性進展的干擾作用，對GBM 患者預后及生存率具有積極意義。

TGF-β 信號通路可介導調節EMT 過程，TGF-β1 通過與其受體TGF-β 受體結合形成跨膜復合物，下游Smad2/3 蛋白被磷酸化并與Smad4 結合形成相對穩定的三聚體復合物易位至細胞核，進而調節EMT 靶基因的轉錄［21］。研究［22］顯示：TGF-β1 可通過Smad2/3 在各種上皮細胞和轉基因小鼠中誘導EMT，同時誘導E-cadherin 蛋白表達水平降低，Vimentin 和Snail 蛋白表達水平升高，并提高癌細胞的遷移和侵襲能力。另有研究［23］顯示：TGF-β1 在低級別和高級別膠質瘤中表達均較正常腦組織明顯上調，TGF-β/Smad 信號激活可促進膠質瘤干細胞樣特性、血管化和治療耐藥等惡性行為，對膠質瘤間充質轉化具有積極誘導作用。本研究結果顯示：與模型組比較，給藥組裸鼠皮下移植瘤組織中TGF-β1 和TβRⅠ mRNA 及蛋白表達水平均降低，同時p-Smad2/3 蛋白表達被抑制，提示川芎嗪可能通過抑制TGF-β1/Smad2/3 信號通路激活，干擾EMT 相關基因轉錄，抑制GSCs 的間充質樣轉化，進而影響GSCs 荷瘤裸鼠的腫瘤惡性進展。

綜上所述，川芎嗪可降低GSCs 裸鼠皮下移植瘤體積及瘤質量，促進腫瘤組織和細胞發生病理性損傷，同時還可抑制TGF-β1/Smad2/3 信號通路激活及EMT 誘導。