Caveolin-2通過Hippo信號通路調控LPS誘導的小鼠肺泡巨噬細胞凋亡

廖浩宇,高 霏,陳 娟,丁偉超,陳 遷,任 藝,張 煒,孫兆瑞,聶時南

0 引 言

肺是人體進行氣體交換的重要器官。由于持續的氣體交換功能,肺部很容易成為空氣中病原體、過敏原或其他有毒物質損傷的靶器官,在敗血癥、肺炎感染期間導致肺損傷[1]。每年,全球有超過2億人死于各種肺損傷疾病[2]。肺損傷可分為急性和慢性,而急性肺損傷(acute lung injury,ALI)或急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)會在短時間內引起肺部大量炎性改變。不可逆的肺損傷是導致ALI/ARDS患者高死亡率的主要原因之一[2-4]。ALI的特點是白細胞聚集、上皮損傷、肺水腫以及彌漫性肺泡損傷,而ARDS是由多種致病因素導致的急性、進行性低氧血癥,最終導致致死性呼吸衰竭[5]。此外,近年來由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)引起的新型冠狀病毒肺炎疫情造成與肺炎相關的ARDS發病率大幅增加,大量患者因此死亡[6]。肺泡巨噬細胞占肺部免疫細胞的55%,在肺損傷炎癥反應期間,通過吞噬吸入顆粒物和外來病原體并誘導細胞因子產生和抗原呈遞來維持體內穩態[7-8]。有證據表明,肺泡巨噬細胞凋亡可以在肺損傷發生時維持肺部結構的穩定性,抑制過度的炎癥反應,從而調控肺損傷的發展[9]。ARDS晚期患者預后極差,目前沒有藥物治療顯示出對改善患者生存有確切好處,影響肺泡巨噬細胞凋亡可能成為ALI/ARDS的治療策略。

Hippo信號通路是一種進化保守的網絡,可以被激素、炎癥因子和微環境細胞類型等激活,通過調節細胞增殖和凋亡,在控制組織穩態、發育和再生方面發揮著核心作用[10-12]。越來越多的研究表明,Hippo信號通路與呼吸系統疾病密切相關,如肺炎、特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)、ALI、哮喘等[13-15]。如Hippo信號通路關鍵蛋白YAP的激活促進肺動脈血管平滑肌細胞增殖,從而導致肺血管重塑,加重了肺動脈高壓;過表達的YAP促進肺成纖維細胞的增殖和膠原沉積,從而促進IPF[14]。此外,Hippo信號通路可能通過促進肺上皮祖細胞的增殖和分化以及干預肺毛細血管內皮的修復,從而參與ALI的修復過程[10]。

小窩(Caveolae)是位于大多數細胞質膜表面約50～100納米的內凹陷樣結構,小窩蛋白(Caveolin,Cav)是形成內陷質膜結構所必需的蛋白質,其參與信號傳導、血管生成、細胞極性、胞吞作用、脂質代謝、膜結構穩定和炎癥反應的調節,是生命活動的重要調節者[16-18]。大量研究證據表明,小窩和Hippo信號通路能夠相互影響,例如小窩通過調節細胞表面積與體積的比率,通過改變機械應力激活Hippo信號通路[17];YAP/TAZ轉錄誘導編碼Cav-1的重要基因,在YAP/TAZ缺陷細胞中,Cav-1的表達水平降低超過85%[19]。而另一些研究表明,肺是Cav-2表達最高的組織之一,Cav-2在沒有Cav-1的情況下也在肺中特別表達,這表明Cav-2可能對肺有顯著影響[18]。在本課題組的前期研究中發現,使用LPS刺激體外培養的小鼠肺泡巨噬細胞,與對照組相比,LPS組肺泡巨噬細胞凋亡比例增加,Cav-2的表達水平明顯升高,YAP的表達水平明顯上調。因此,我們推測Cav-2的表達可能通過Hippo信號通路調節肺泡巨噬細胞凋亡。綜上所述,本研究旨在探究Cav-2/Hippo信號通路對肺泡巨噬細胞炎癥和凋亡的影響,為肺部炎性疾病的治療提供新的靶標。

1 材料與方法

1.1 主要試劑FBS血清(上海碧云天),RPMI-1640培養基(上海賽默飛),LPS脂多糖(上海賽默飛),SDS裂解液(上海碧云天),電泳緩沖液(美國Biorad公司),電轉緩沖液(北京索萊寶),SYBR(上?？苿撨_),Lipofectamine 2000,(上海賽默飛),BCA蛋白測定試劑盒(上海碧云天),總RNA提取試劑盒(武漢伊萊瑞特),逆轉錄試劑盒(武漢伊萊瑞特),TNF-αELISA檢測試劑盒(ab208348,美國Abcam),IL-1βELISA檢測試劑盒(ab197742,美國Abcam),IL-6ELISA檢測試劑盒(ab100713,美國Abcam),CCK-8檢測試劑盒(上海碧云天),ROS檢測試劑盒(上海碧云天),Cav-2-shRNA(R208255547,美國Abcam),Cav-2+DNA(R208255548,美國Abcam),HRP標記的羊抗兔二抗(146270,美國Jackson immune research),熒光標記的羊抗兔二抗Alexa FluorTM488 donkey anti-rabbit IgG H+L (2156521,上海賽默飛),Bax(1∶1000,2772S,CST),Bcl-2(1∶2000,ab182858,Abcam),Bak(1∶1000,12105S,CST),cleaved-Caspase-3(1∶1000,9661S,CST),Caspase-3(1∶1000,9662S,CST),GAPDH(1∶10000,AB0037,Abways technology),YAP(1∶1000,8418T,CST),p-YAP(1∶1000,13008T,CST),Caveolin-2(1∶1000,Ab133484,Abcam)。

1.2實驗方法

1.2.1 細胞培養小鼠肺泡巨噬細胞系MH-S購自美國ATCC細胞庫。用含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養基,于37℃含5%CO2的孵箱中培養。待MH-S細胞生長至80%密度左右進行傳代,接種于不同培養皿中,取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2細胞轉染細胞轉染前,將125 μL的RPMI-1640培養基與5 μL的Lipofectamine 2000混合,再將125 μL的RPMI-1640培養基分別和10 μL的Cav2-shRNA與3.6 μL的Cav-2+DNA混合,室溫下靜置5 min,之后將Lipofectamine 2000與RPMI-1640培養基的混合物與含有Cav2-shRNA或Cav-2+DNA的RPMI-1640培養基混合,吹打混勻并室溫下靜置20 min。6孔板中MH-S細胞生長至60%～70%密度后,向每孔加入1 mL無血清無抗生素的RPMI-1640培養基和250 μL的混合物,在溫箱中靜置8 h后棄液,加入2 mL含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養基繼續培養。采用qRT-PCR和Western blot檢測轉染效率。

1.2.3實驗分組將生長狀態良好的MH-S細胞隨機分為4組。①Control組:用于對照研究,正常培養;②LPS組:予不同濃度的LPS(0、0.1、1、5、10、20 μg/mL)處理24 h;固定濃度的LPS(10 μg/mL)處理不同時間(0、3、6、12、18、24 h);③sh-Cav-2組:使用Cav-2-shRNA轉染細胞,后使用10 μg/mL LPS處理24 h;④OE-Cav-2組:使用Cav-2+DNA轉染細胞,后使用10 μg/mL LPS處理24 h。

1.2.4CCK-8檢測細胞活力將處理后的各組細胞接種于96孔板中,細胞密度為5×103/孔。培養24 h后,向每孔細胞中加入10 μL CCK-8溶液,37 ℃孵育2 h后,使用多功能酶標儀測定在450 nm處的吸光度,使用比值法計算細胞活力。該實驗獨立重復3次。

1.2.5ROS檢測細胞活性氧水平將處理后的各組細胞均勻接種于孔板中,培養24 h后,吸凈培養基,PBS洗滌1～2次,加入100 μL的DCFH-DA工作液,置于溫箱中避光孵育30 min。吸除DCFH-DA工作液,用PBS洗滌2～3次,最后用PBS覆蓋細胞,孔板內標記好的細胞直接置于共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.6細胞免疫熒光將處理后的各組細胞均勻接種于小皿,培養24 h。吸掉培養基,向每小皿加入2 mL 4%多聚甲醛室溫固定10 min,PBS潤洗,加入2 mL 0.2%Triton-100室溫5 min,PBS潤洗,加入100 μL封閉液室溫封閉1h,PBS潤洗。加入一抗,濕盒4 ℃孵育過夜,PBS潤洗,加入二抗,濕盒室溫孵育2 h,PBS潤洗,加入DAPI聚核5 min,PBS潤洗,甘油淬滅封片,將切片置于熒光顯微鏡下拍片。

1.2.7逆轉錄定量PCR(qRT-PCR)用RNA提取試劑盒進行總RNA提取,按試劑盒說明書進行操作,通過基因擴增儀進行逆轉錄。取PCR反應板,配制如下反應體系:SYBR10.0 μL,Forward Primer(10 μmol/L)和Reverse Primer(10 μmol/L)各0.4 μL,DEPC水7.2 μL,cDNA2.0 μL(Total 20 μL),每個樣本做4個復孔。通過實時熒光定量PCR儀進行基因擴增,結束后導出實驗數據,以GAPDH為內參進行歸一化處理,用2-ΔΔCT法處理結果。實驗獨立重復3次。目的基因的引物序列見表1。

表 1 PCR引物序列信息Table 1 PCRprimer sequence information

1.2.8蛋白質免疫印跡收集MH-S細胞,加入RIPA裂解液充分裂解,離心30 min收集上清,使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。加入SDS-PAGE上樣緩沖液,100 ℃金屬浴12 min,震蕩混勻離心。上樣,80 V 30 min,120 V 90 min恒壓電泳,400 mA 30 min恒流轉膜。5%脫脂奶粉封閉,一抗4 ℃孵育過夜,TBST緩沖液3次×5 min,二抗室溫孵育100 min,TBST緩沖液3次×5 min,ECL發光液進行曝光,保存條帶。實驗重復進行3次。

1.2.9酶聯免疫吸附試驗將處于對數生長期的MH-S細胞接種于24孔板中,收集各組細胞上清,根據ELISA試劑盒說明,檢測MH-S細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平,然后使用多功能酶標儀測定450 nm波長處的A值。實驗重復進行3次。

2 結 果

2.1 LPS對MH-S細胞凋亡及活力的影響CCK-8結果顯示,與對照組相比,10 μg/mL LPS濃度組細胞存活率下降至(74.26±2.6)%(P<0.01),10 μg/mL及更高濃度組能夠明顯降低細胞活力,差異有統計學意義(P<0.01)。Western blot結果顯示,隨著LPS作用濃度的升高,促凋亡蛋白Bak、Bax、cleaved-Caspase-3/Caspase-3表達水平升高,抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平降低(P<0.05),提示LPS濃度與MH-S細胞凋亡呈正相關。見圖1。

2.2LPS對YAP及Cav-2的影響Western blot檢測結果顯示,Hippo信號通路關鍵蛋白YAP的表達水平隨著LPS的作用濃度增加而升高,p-YAP的表達水平降低(P<0.05)。細胞免疫熒光檢測結果顯示,與Control組相比,10 μg/mL LPS組YAP蛋白的熒光表達水平升高(P<0.05),提示在MH-S細胞中,Hippo信號通路關鍵蛋白YAP的表達水平與LPS處理濃度呈正相關。此外,隨著LPS的作用濃度逐漸升高,Cav-2表達水平亦升高(P<0.05),提示在MH-S細胞中,Cav-2的表達水平與LPS作用濃度呈正相關。隨著LPS作用時間的增加,YAP蛋白的表達水平升高,p-YAP蛋白的表達水平降低(P<0.05)。此外,Cav-2的表達水平也隨著LPS作用時間的增加而升高(P<0.01),其變化趨勢與YAP蛋白的表達水平變化趨勢相一致。見圖2。

a:蛋白質免疫印跡檢測凋亡蛋白代表條帶;b:凋亡蛋白表達水平1:Control組; 2:0.1 μg/mL; 3:1 μg/mL; 4:5 μg/mL; 5:10 μg/mL; 6:20 μg/mL與Control組相比,*P<0.05、**P<0.01

a、e:蛋白質免疫印跡檢測YAP、p-YAP、Cav-2蛋白條帶;b、f:YAP蛋白表達水平;c、g:p-YAP蛋白表達水平;d、h:Cav-2蛋白表達水平1:Control組;2:0.1 μg/mL;3:1 μg/mL;4:5 μg/mL;5:10 μg/mL;6:20 μg/mL;7:Control;8:3 h;9:6 h;10:12 h;11:18 h;12:24 h與Control組相比,*P<0.05、**P<0.01

2.3Cav-2對炎癥因子及活性氧表達水平的影響采用Cav-2-shRNA及Cav-2+DNA轉染MH-S細胞構建Cav-2低表達和過表達載體,qRT-PCR檢測結果表明細胞均轉染成功(P<0.01)。qRT-PCR檢測結果顯示,與LPS組相比,sh-Cav-2組TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達水平顯著降低(P<0.01);OE-Cav-2組上述炎癥因子的mRNA表達水平顯著升高(P<0.01)。ELISA檢測結果也表明,與LPS組相比,sh-Cav-2組MH-S細胞培養上清液炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表達水平降低(P<0.05);OE-Cav-2組上述蛋白表達水平升高(P<0.05)。提示抑制Cav-2的表達可抑制LPS誘導的炎性反應。ROS檢測結果顯示,與LPS組相比,sh-Cav-2組細胞活性氧水平降低(P<0.05);OE-Cav-2組細胞活性氧水平升高(P<0.05),提示Cav-2能夠調節細胞ROS生成等氧化應激過程。見圖3。

2.4Cav-2對YAP的表達影響qRT-PCR檢測結果顯示,與LPS組相比,sh-Cav-2組YAP的mRNA表達水平下調(P<0.05);OE-Cav-2組YAP的mRNA表達水平升高(P<0.05)。Western blot檢測結果表明,與LPS組相比,sh-Cav-2組YAP蛋白表達水平降低(P<0.05),p-YAP蛋白表達水平升高(P<0.01);OE-Cav-2組YAP蛋白表達水平升高(P<0.05),p-YAP蛋白表達水平降低(P<0.01)。細胞免疫熒光檢測結果顯示,與LPS組相比,sh-Cav-2組YAP蛋白的熒光表達水平顯著降低(P<0.01);OE-Cav-2組YAP蛋白的熒光表達水平顯著升高(P<0.01)。見圖4。

2.5Cav-2對細胞凋亡的表達影響Western blot檢測結果顯示,與LPS組相比,sh-Cav-2組促凋亡蛋白Bak、Bax、cleaved-Caspase-3/Caspase-3的表達水平降低,抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平升高(P<0.05);OE-Cav-2組促凋亡蛋白的表達水平升高,抗凋亡蛋白的表達水平降低(P<0.05)。上述結果表明,抑制Cav-2的表達可以抑制LPS誘導的MH-S細胞凋亡。見圖5。

a:qRT-PCR檢測Cav-2的mRNA表達水平;b、c、d:qRT-PCR檢測TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達水平;e、f、g:ELISA檢測TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表達水平;h:ROS檢測細胞活性氧水平與Control組相比,*P<0.05、**P<0.01;與LPS組相比,*P<0.05、**P<0.011:Control;2:LPS;3:sh-Cav-2;4:OE-Cav-2

a:qRT-PCR檢測YAP的mRNA表達水平;b:YAP蛋白熒光表達水平;c:蛋白質免疫印跡檢測YAP、p-YAP蛋白條帶;d:YAP蛋白表達水平;e:p-YAP蛋白表達水平;f:細胞免疫熒光檢測YAP蛋白1:Control組;2:LPS;3:sh-Cav-2;4:OE-Cav-2與Control組相比,**P<0.01;與LPS組相比,#P<0.05、##P<0.01

a:蛋白質免疫印跡檢測凋亡蛋白條帶;b:cleaved-Caspase-3/Caspase-3表達水平;c:Bak蛋白表達水平;d:Bax蛋白表達水平;e:Bcl-2蛋白表達水平1:Control組;2:LPS;3:sh-Cav-2;4:OE-Cav-2與Control組相比,*P<0.05、**P<0.01;與LPS組相比,#P<0.05、##P<0.01

3 討 論

肺部疾病是世界范圍內常見的健康問題,為醫療系統帶來沉重負擔[1]。在肺部疾病的發生發展過程中,免疫炎癥反應是重要的病理生理機制,肺泡巨噬細胞(AMs)是最易受到影響的細胞[20]。已有研究表明AMs和其他免疫細胞在調節肺部炎癥中協同工作,過度的肺部炎癥和肺泡上皮細胞凋亡是ALI發病的關鍵因素[21]。

小窩是富含膽固醇和糖鞘脂的燒瓶狀質膜內陷,在血管內皮中特別豐富,在血管平滑肌細胞、巨噬細胞、心肌細胞和成纖維細胞中也廣泛存在[22]。小窩蛋白是小窩的主要蛋白質成分,以Cav-1分布最為廣泛,而Cav-2同樣是小窩的重要組成部分,輔助Cav-1或獨立發揮生物學功能[16]。已有研究報道在不同的組織細胞內Cav-1參與炎癥及Hippo信號通路的調控,Cav-1與toll樣受體(TLR)結合,減少了促炎細胞因子的產生,并部分增強了抗炎細胞因子的生成[23]。對Cav-2的作用研究遠少于對Cav-1的研究,但是與Cav-1相比,Cav-2通常表現出相反的活性。例如,有研究發現在LPS誘導的ALI小鼠模型中,miR-1443p通過調節Cav-2的表達,以增強ALI的炎癥反應和細胞凋亡[24]。在本研究中,對Cav-2的檢測表明,隨LPS的刺激強度和時間增加,Cav-2的表達水平升高,呈時間濃度梯度依賴性。抑制Cav-2的表達可以抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放,抑制肺泡巨噬細胞凋亡;而過表達Cav-2可以促進炎癥因子的釋放,促進肺泡巨噬細胞凋亡。

Hippo信號通路發揮調控細胞增殖、凋亡及組織再生的作用,轉錄共刺激因子YAP/TAZ是Hippo信號通路的效應蛋白,當Hippo信號通路激活,YAP/TAZ被磷酸化修飾,抑制其與轉錄因子TEAD結合調控下游靶基因的表達[25]。既往許多研究顯示Hippo信號通路參與免疫炎癥的調控,如肺康顆?？梢允笴OPD大鼠的MST1/2表達升高,通過抑制Th17細胞分化,調控DC的遷移及黏附來抑制趨化因子和促炎細胞因子產生[26];YAP缺乏導致機械通氣誘導的肺水腫、出血和炎癥細胞浸潤減少[27]。Hippo信號通路和小窩之間的相互作用是這些疾病狀態的基礎。盡管小窩調節Hippo信號通路的確切機制尚不完整,但仍存在一些可能的機制,例如在成肌細胞中,拉伸誘導的小窩分解直接激活YAP的磷酸化,導致SRC激活。低滲透應激使小窩內陷變平,通過NLK激酶介導YAP的Ser128磷酸化刺激YAP的瞬時核定位[13]。在本研究中我們通過Cav-2-shRNA穩定轉染低表達Cav-2基因,通過Cav-2+DNA穩定轉染過表達Cav-2基因,獲得定向低表達和過表達Cav-2的MH-S細胞模型,我們的研究結果顯示,相比于LPS組,定向抑制Cav-2的表達可以使Hippo信號通路中YAP的mRNA和蛋白表達水平下降,p-YAP蛋白表達水平升高,促凋亡相關蛋白指標下降。而過表達Cav-2可以使Hippo信號通路中YAP的mRNA和表達水平升高,p-YAP表達水平降低,促凋亡相關蛋白指標升高。結果表明在LPS誘導的肺泡巨噬細胞模型中,Cav-2可以促進YAP的基因及蛋白表達,抑制Hippo信號通路,促進炎癥因子的釋放,加重巨噬細胞損傷、凋亡。

綜上所述,本研究揭示了在LPS誘導的肺泡巨噬細胞凋亡中,Cav-2可以加重LPS誘導的巨噬細胞損傷、凋亡,定向抑制Cav-2的表達可以通過減少YAP入核,激活Hippo信號通路,阻止炎癥因子的釋放,減輕LPS誘導的巨噬細胞損傷、凋亡。因此,Cav-2可能作為干預肺部炎性疾病的潛在治療靶標。而本研究僅在細胞水平上對Cav-2在肺泡巨噬細胞凋亡過程中的作用和機制進行了研究,后期將進一步對其在動物及臨床上進行深入探究。