深度測序技術在畜禽疫病診斷中的應用

張 立

(榆樹市環城鄉綜合服務中心,吉林 榆樹 130400)

近幾十年來,畜禽疫病的經典直接診斷方法,即病毒分離或細菌培養后鑒定病原體特性,有逐漸被一系列新的分子技術取代的趨勢。后者可以在含有病毒或細菌核酸或蛋白質等成分的臨床樣本中檢測到感染因子。測定核苷酸序列的方法被稱為“測序技術”。20世紀70年代電泳法用于DNA測序的引入使獲取基因序列信息成為可能,基于雙脫氧鏈終止技術的桑格測序迅速成為DNA測序的首選方法。

Sanger測序代表了測序技術的“第一代”,而由于對哺乳動物大基因組測序更快、更便宜方法的需求不斷增長,2005年,以羅氏454、Illumina Solex、ABI Solid sequencer為代表的“第二代”高通量測序發展起來,可以同時對幾十萬、上百萬條DNA分子進行測序。2019年開始,以實時單分子為特點的三代測序技術興起,如Pacbio SMRT及牛津納米孔單分子測序儀。第二、三代測序技術統稱為深度測序(deep sequencing),又稱高通量測序(High-Throughput Sequencing)、下一代測序(Next Generation Sequencing,NGS)。上述的不同技術平臺均有其獨特的測序方法,但大多數都有相同的總體策略,即在固體支持基質上克隆擴增DNA模板,然后通過大規模并行測序反應的循環過程進行測序。

1 深度測序技術

NGS在檢測和發現新型病原體方面顯示出了巨大潛力,包括已知感染向新領域的傳播和/或完全新穎的“未知”病原體的出現。與之前的技術不同,NGS不存在偏倚,能反饋出原始樣本中存在的大多數核苷酸序列。然而,與早期技術一樣,其檢測下限最終仍取決于病原體相對于宿主背景物質的豐度。NGS技術的持續發展,也在繼續提高檢測低拷貝數病原體的可能性。此外,采樣、樣品制備和富集方案都對基于NGS的診斷結果有顯著影響。

圖1 使用高通量測序檢測病原體的工作流程

2005年Margulies M等人發表在Nature上的一篇文獻中介紹了一種使用單個孔的新型光纖載玻片,能夠在一次四小時的運行中以99%甚至更高的精度對2 500萬個堿基進行測序的系統,下圖是測序系統樣品制備流程。

圖2 深度測序樣品制備流程

(A)從左上角順時針方向:(i)基因組DNA被分離,片段化,連接到適配器并分離成單鏈;(ii)片段與單個磁珠結合,珠子被捕獲在油乳劑中的PCR反應混合物的液滴中,然后在每個液滴中進行PCR擴增,每個珠粒攜帶一千萬份特異性的DNA模板;(iii)乳液破裂,DNA鏈變性,攜帶單鏈DNA克隆的珠子沉積到光纖載玻片的孔中;(iv)將攜帶焦磷酸鹽測序所需的固定化酶的較小珠子沉積到每個孔中。(B)乳液的顯微鏡照片,顯示含有珠子的液滴和空液滴。細箭頭指向28μm珠子,粗箭頭指向約100μm液滴。(C)光纖載玻片部分的掃描電子顯微鏡圖片,顯示了磁珠沉積前的光纖包層和孔。

2 NGS在畜禽疫病診斷方面的具體應用實例

現階段,畜禽疫病面臨著老病多發、新病頻發、未病不能先知的復雜局面。病原檢測需要快速、高通量、精準、實際,才能滿足高度工業化養殖模式下的疫病防控需要。疫病的監測需要了解全病原譜的感染與傳播動態。NGS的應用和發展為畜禽疫病診斷提供了巨大幫助,具體應用實例如下。

2.1 健康豬群的大規模精準監測

軍事科學院涂長春團隊通過病毒宏基因組以及NGS技術建立了迄今為止最全面的豬病毒組數據庫Pigs_VIRES,涵蓋66個科249個病毒屬的96 586個病毒基因,將全球豬病毒組基因庫擴大近三倍。并首次提出了病毒組的“精準監測”模式,用于豬病毒病的精準監測與排查。

2.2 復雜疾病的各種感染因子排查

在針對多病原混合感染導致的疾病診斷方面,NGS不需要了解可疑感染病原的特征,即可以檢測出樣本中包含的大部分核酸。研究人員采集患有仔豬多系統衰竭綜合征(PMWS)的豬以及健康豬的淋巴結進行病毒組學研究。豬圓環病毒2型(PCV2)是公認的PMWS主要病原因子,但研究結果患有PMWS豬在PCV2高背景下也發現了其他病毒,包括一種豬瘟病毒,與2015年在美國發現的非典型豬瘟病毒高度相似,以及一些小核糖核酸病毒,類圓環病毒、博卡病毒等,通過對患病豬和無癥狀豬的分析,證實了PMWS也與這些病毒有關,并且各種感染因子可能存在協同作用。

2.3 新病原體的發現

2011年,在德國施馬倫貝格鎮附近的一個農場,對發熱和產奶量降低的三份牛血漿樣本的RNA文庫進行重復測序,獲得了22個病毒的特異性序列,通過Sanger測序和細胞培養分離物的NGS來填補一些序列空白。經序列比較分析和系統發育研究,該病毒為正布尼亞病毒屬的Shamonda樣病毒,將其命名為施馬倫伯格病毒(Schmallenberg,SBV)。隨后,SBV在西歐國家的反芻動物中大規模流行,臨床特征是流產和新生兒先天性畸形15?？梢?深度測序技術在鑒定未知病毒方面發揮了重要作用。

2.4 研究宿主-病原體相互作用關系

豬繁殖和呼吸綜合征(PRRS)一直是影響全球養豬業的最重要的經濟疾病之一,每年造成巨大的經濟損失,利用高通量測序技術可以幫助了解宿主對病毒感染的反應機制,進一步了解感染病理學。Xiao等人首次使用Illumina深度測序技術對經典北美型PRRSV(N-PRRSV)毒株CH-1a感染的全基因組宿主轉錄反應進行研究,并系統地分析了N-PRRSV感染后肺基因表達譜與感染病理學之間的關系。結果表明,N-PRRSV通過多種方式在感染豬中復制和傳播,包括破壞宿主先天免疫反應,誘導抗凋亡和抗炎狀態以及發展抗體依賴性增強(ADE)。

2.5 監測疾病暴發和傳播途徑

NGS可以作為研究畜禽疾病暴發的重要工具,通過確定和跟蹤傳播途徑,提高感染源的可追溯性。2020年10月至2021年6月期間,H5Nx亞型高致病性禽流感(HPAI)病毒在荷蘭的家禽、圈養鳥類和野生鳥類中引起疫情?；贜GS的全基因組比較分析,研究人員在33種死亡野生鳥類中分析143種病毒的全基因組序列,結果表明高致病性禽流感病毒主要為H5N8亞型。遺傳分析表明,在荷蘭發生了多次獨立引入HPAI H5N8病毒,隨后可能在當地傳播,而家禽中的暴發可能是由野鳥的遷徙引入的。

2.6 病毒種群內和種群間遺傳多樣性的特征評估

NGS為描述病毒準種的突變譜開辟了新的可能性,而下一代測序和復雜的生物信息學工具的進步已經能夠檢測到低頻變異。Andino和Domingo的綜述回顧了通過NGS了解病毒種群動態,特別是“突變譜內的相互作用,以及適應度景觀對病毒適應和去適應的影響”18。共存的病毒亞群對疾病發展的影響也進行了評估,根據Lu等人的研究,基于NGS的病毒變異全基因組比較已經確定了PRRSV的功能重要區域,此外,從不同基因型毒株中獲得的進化變異為病毒發育組學提供了有用信息。

2.7 新發傳染病防控關口前移

有研究團隊在2017年至2021年期間,對中國20個省份野味動物病毒病原體進行了原轉錄組學分析。完整的樣本收集涉及5個哺乳動物類群,包括果子貍、穿山甲、豪豬、刺猬在內的18 個物種的1 941只動物,采集呼吸道和糞便樣本。在鑒定到的102種脊椎動物相關病毒中,21種病毒被認定為“高?！辈《?。其中果子貍攜帶的潛在高風險病毒數量最多,且這些“高?！辈《驹诓煌拔秳游镏写嬖陬l繁的跨物種傳播現象。研究人員在果子貍和亞洲獾中發現了甲型禽流感病毒H9N2,后者表現出呼吸道癥狀,并可能存在人向野生動物傳播的情況?；谏疃葴y序技術的研究強調了野味動物作為人畜共患病潛在驅動因素的重要性,為那些可能導致下一次大流行或動物流行病的野味動物及其病毒提供了重要的見解。

3 深度測序和在疾病診斷的前景

傳統診斷方法和深度測序技術各有優缺點,傳統診斷方法如病毒分離可以獲得有價值的毒株,對于感染生物學研究,開發新疫苗和免疫治療產品至關重要,但缺點是無法分離、檢測在現有細胞培養系統中不能增殖的病毒,且耗時相對長。NGS技術的檢測范圍廣,不需要對病原體進行分離培養,不需要設計目的序列的針對性引物,不依賴病原體遺傳背景,但其也有一定局限性,即不能獲得分離毒株,且其運行設備及試劑耗材的價格高昂,后期數據分析要求有豐富的生物信息學經驗,以及NGS研究方法的標準與序列數據生成、分析、注釋和報告流程規范的缺失和不完善,極大地限制了NGS在獸醫臨床的廣泛應用22。在未來,需要研制成本更低的設備,開發價格更低的配套試劑和耗材,同時提高用戶友好性和診斷實驗室的可訪問性,使非專業用戶更方便對測序結果進行分析23。

無可置疑,NGS已經給獸醫臨床工作帶來了巨大的變革。相信隨著成本的降低和技術的改進,NGS技術在獸醫臨床中會成為必不可少的診斷工具并發揮舉足輕重的作用,提高疾病診斷效率,促進養殖行業的健康發展。