肝細胞癌組織HOXC9和KIF4A表達及其臨床意義探討*

何圣科,蒲江漢,馮海玲,吳大平,陳綿軍,陳 輝

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝臟最常見的原發性惡性腫瘤,是全球第五大常見的惡性腫瘤之一,高居癌癥相關死因的第二位[1]。目前,HCC的病因和發生機制尚未完全明確,其遺傳異質性強,腫瘤發生發展涉及到多基因、多步驟、多環節的改變和相互作用。相關基因水平和功能也在HCC發生、發展和轉移過程中發揮重要的作用[2,3]。同源盒基因C9(homeobox C9,HOXC9)是HOX基因家族成員,其包含參與脊椎動物胚胎發育的同源結構域,在胚胎的前-后軸形成過程中起到重要的作用[4]。目前已有報道顯示,在胃癌和肺癌等多種腫瘤均存在HOXC9異常表達。HOXC9異常表達與腫瘤發生和發展關系密切[5-7]。驅動蛋白家族成員4A(kinesin family member 4A,KIF4A)是參與染色體的凝集和分離、紡錘體形成和細胞內大分子運輸等生理過程的驅動蛋白超家族成員。多項研究發現KIF4A表達失調參與了乳腺癌和肺癌等腫瘤的發生和發展[8,9]。各種腫瘤組織HOXC9和KIF4A表達異?，F象已引起了學者們的廣泛關注。本研究采用免疫組化法檢測了HCC組織HOXC9和KIF4A蛋白表達情況,并分析了它們與腫瘤病理學特征和臨床預后的關系,現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2018年1月～2021年1月我院診治的HCC患者86例,男性58例,女性28例;年齡為48～69歲,平均年齡為(57.4±6.9)歲。HCC的診斷參照《原發性肝癌診療規范(2017年版)》[10]的標準,均經影像學檢查和術后組織病理學檢查診斷為HCC。其中,單發病灶36例,多發病灶50例;TNM Ⅰa/Ⅱa期46例,Ⅱb/Ⅲb期40例;在顯微鏡下見內皮細胞襯覆的血管腔內有癌細胞巢團,即微血管浸潤者37例,無微血管侵犯49例。排除標準：(1)無法耐受手術治療;(2)存在其他類型的肝癌或合并其他惡性腫瘤;(3)術前接受過放療、化療或免疫治療;(4)有肝移植手術史;(5)存在人類免疫缺陷病毒感染;(6)存在心、腦、肺、腎等重要臟器功能障礙。本研究通過我院醫學倫理委員審核,批準實施?；颊吆炇鹬橥鈺?。

1.2 手術方法 根據腫瘤大小、數目、部位和分期,選擇行肝葉、肝段、半肝和局部切除術治療。無菌取癌組織和癌旁肝組織,置于-80℃冰箱凍存。

1.3 癌組織和癌旁肝組織HOXC9和KIF4A蛋白表達檢測 采用免疫組化法檢測。取組織,加二甲苯脫蠟、梯度酒精水化,再置于0.01 mol/L檸檬酸緩沖液中高溫修復抗原12 min,冷卻5 min;經磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌,滴加3%過氧化氫溶液,室溫避光孵育25 min,以滅活內源性過氧化物酶;用PBS緩沖液洗滌,加入山羊血清白蛋白封閉非特異性位點,再分別加入稀釋后的兔抗人HOXC9多克隆抗體(美國Abcam,1：200稀釋)或兔抗人 KIF4A多克隆抗體(美國Abcam,1：150稀釋),4 ℃下孵育過夜;次日,經PBS 緩沖液洗滌,加入酶標二抗(北京中杉金橋生物技術開發公司),37℃下孵育30 min;加入二氨基聯苯胺(北京中杉金橋生物技術開發公司)顯色,自來水沖洗,蒸餾水沖洗,用蘇木素復染,再用PBS緩沖液洗滌、返藍,常規脫水透明,用中性樹膠封片。以PBS緩沖液或已知陽性切片,分別作為陰性或陽性對照。在200倍顯微鏡下觀察整張切片,隨機選擇每張切片的5個視野,每個視野計數100個細胞。根據陽性細胞百分比和染色強度評分,陽性細胞百分比計分為無(0分)、<25%(1分)、25%～50%(2分)、>50%(3分);無著色(0分)、淡黃色(1分)、棕黃色(2分)、棕褐色(3分)。上述2項評分的乘積<3為低表達,≥3為高表達。

1.4 隨訪 通過門診復診或電話隨訪2年。第1年每3個月隨訪1次,第2年每6個月隨訪1次。隨訪終點為患者全因死亡或截至到2023年1月,記錄生存情況。

1.5 統計學方法 應用R 4.1.2軟件進行統計學分析。對計量資料先行Shapiro-Wilk檢驗,判斷是否服從正態分布。對非正態分布者,以M (P25,P75)表示,采用秩和檢驗。計數資料以%表示,采用x2檢驗或Fishers確切概率計算。應用Kaplan-Meier繪制生存曲線,采用Log Rank檢驗比較累積生存率?？尚艆^間為95%,所有檢驗均為雙側檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC患者癌組織與癌旁肝組織HOXC9和KIF4A蛋白陽性率比較 HCC癌組織HOXC和KIF4A高表達陽性率均顯著高于癌旁肝組織(P<0.05,表1,圖1、圖2)。

表1 HCC患者癌組織與癌旁組織HOXC9和KIF4A陽性率(%)比較

圖1 HCC患者肝組織HOXC9蛋白表達(ABC, 200×)左：癌旁肝組織;右：癌組織

圖2 HCC患者肝組織KIF4A蛋白表達(ABC, 200×)左：癌旁肝組織;右：癌組織

2.2 不同臨床和病理學特征的HCC組織HOXC9和KIF4A蛋白高表達陽性率比較 腫瘤低分化和中分化、TNM Ⅱb/Ⅲb期、腫瘤包膜侵犯和發生微血管浸潤的癌組織HOXC9和KIF4A高表達陽性率均顯著高于高分化、TNM Ⅰa/Ⅱa期、無腫瘤包膜侵犯或無血管浸潤的癌組織表達(P<0.05,表2)。

表2 不同臨床和病理學特征的癌組織HOXC9和KIF4A蛋白高表達(%)比較

2.3 HCC癌組織HOXC9和KIF4A蛋白高表達與低表達患者生存情況比較 術后隨訪2年,86例患者生存38例(44.2%),死亡48例(55.8%);Log-rank分析顯示,癌組織HOXC9蛋白高表達患者生存期顯著短于低表達患者,癌組織KIF4A蛋白高表達患者生存期也顯著短于KIF4A蛋白低表達患者(P<0.05,表3,圖3)。

表3 癌組織蛋白高表達與低表達患者生存時間[M(P25,P75)]比較

圖3 HCC癌組織蛋白高表達與低表達患者生存時間比較左：HOXC9蛋白;右：KIF4A蛋白

3 討論

HOXC9是具有高度保守性的調節基因,可控制胚胎發育、細胞分化和生長發育,其表達異常能夠促進侵襲性腫瘤的DNA修復、侵襲、遷移、誘導血管生成等特征,在腫瘤細胞異常增殖、形成新生腫瘤組織微血管、轉移等病理過程中發揮促進作用[11-14]。已有報道[15-17]顯示,HOXC9表達上調可通過調節腫瘤生長和轉移促進頭頸部鱗狀細胞癌的進展。沉默HOXC9能夠賦予藥物誘導的神經母細胞瘤細胞分化抗性,即產生抗腫瘤效果。本研究結果顯示,86例患者HCC癌組織HOXC9高表達陽性率為69.8%,較癌旁肝組織15.1%更高,提示HOXC9在HCC顯示為癌基因,可能參與了HCC的發生發展。KOXC9在甲狀腺癌顯示為抑癌基因,其低表達與甲狀腺癌的發生和淋巴結轉移有關。由此可見HOXC9在不同腫瘤細胞中的調控作用并不一致,具體機制仍有待探究。在不同分化程度、不同TNM分期、有無腫瘤包膜侵犯和有無微血管侵犯的HCC患者HOXC9高表達陽性率不同。本研究經生存分析顯示,HCC癌組織HOXC9蛋白高表達患者生存期顯著短于HOXC9蛋白低表達患者,提示HOXC9蛋白高表達與患者預后不良有關,與既往報道[18]結直腸癌HOXC9過表達提示預后不良的結果類似。

KIF4A是參與有絲分裂和胞質分裂過程的馬達驅動蛋白家族成員,在有絲分裂過程中染色體凝聚和分離的調控方面發揮著重要的作用,其異常表達與有絲分裂異常和非整倍體細胞的形成有關[19]?；赨ALCAN 在線數據庫分析發現,CDCA5、KIF4A、TPX2和FOXM1過表達共同調控細胞周期,促進HCC的發生和發展。叉頭框蛋白M1(fork head box protein M1,FOXM1)作為增殖相關的轉錄因子在腫瘤組織表達上調,HCC的發生發展存在FOXM1-KIF4A軸作用,FOXM1過表達能夠調控下游靶標KIF4A表達增強,從而對癌細胞增殖、遷移和入侵產生促進作用[20]。本研究經生存分析顯示,HCC癌組織KIF4A蛋白高表達患者生存期顯著短于KIF4A蛋白低表達患者,提示KIF4A蛋白高表達與患者不良預后有關。有研究發現,KIF2C/4A/10/11/14/18B/20A/23表達上調不僅與HCC的病理學分級和腫瘤分期有關,還與患者預后不良有關,提示KIF4A蛋白是否可以作為HCC患者預后的生物標志物,值得進一步研究。