TSP1在泌尿系統中的研究進展

龍軍, 陳林, 汪松, 周鑫, 楊進, 吳金邦, 吳波

細胞外基質(extracellular matrix,ECM)是由細胞分泌到細胞外間質中的大分子物質所構成的復雜網架動態結構,由間質基質和基底膜構成,占機體質量的1/3以上。細胞外基質包括許多成分,例如結構蛋白(膠原纖維、彈性纖維等),連接蛋白(整合蛋白、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白等),非結構蛋白(基質細胞蛋白、聚糖蛋白、透明質酸等),在組織重塑和維持結構穩定中起著重要作用[1-2]。

血小板反應蛋白(thrombospondins,Thbs/TSPs)屬于鈣結合的細胞外基質聚糖蛋白,依據其低聚狀態以及結構特點分為三聚體(TSP1/2)和五聚體(TSP3/4/5)兩類[3-7]。由于TSPs具有多結構域的特點,因此在某一微環境下,能與不同的分子相結合從而發揮不同的生物學功能,調節細胞之間以及細胞與基質之間的相互作用。

TSP1是發現最早同時也是研究最為廣泛的TSPs家族成員,在許多種細胞(樹突細胞、巨噬細胞、血管平滑肌細胞、上皮細胞等)中均有表達[8],通過與受體或其他細胞外基質成分直接或間接互作發揮調控作用,包括細胞增殖與分化、細胞遷移、細胞粘連、細胞凋亡以及血管生成穩態、免疫及傷口愈合等,參與了多種疾病的發生發展,如非腫瘤疾病中的纖維化調控和腫瘤疾病中的血管穩態調節作用[3, 9-13]。充分認識和深入研究TSP1在泌尿系統疾病中的作用,將為泌尿系疾病的診斷和治療提供新的策略。

1 TSP1的概述

1.1 TSP1的結構 TSP1是血小板α顆粒中釋放的一種細胞外基質糖蛋白,具有多結構域特性,包括N端域、前膠原同源域、I 型重復域、Ⅱ 型重復域(EGF樣Ⅱ型重復域)、Ⅲ型重復域及C端域[3, 7, 14-19](圖1)。每種結構域都能與不同的配體或受體結合從而發揮不同的生物學功能。N端域作用受體包括肝素(heparin)、糖脂(glycolipid)和低密度脂蛋白受體相關蛋白等,參與調節新生血管的生成;I 型重復域能與基質金屬蛋白激酶2/9(MMP2/9)及CD36等相互作用,起到抑制新生血管生成的作用;Ⅱ 型重復域又稱為EGF樣Ⅱ型重復域,能與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)等受體互作,主要在中樞神經系統調節中發揮功能;Ⅲ型重復域也能通過結合堿性成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor 2,FGF2)進而抑制新生血管形成。通過作用于不同的對象,TSP1在許多信號通路中都起著關鍵的調控作用,在病理狀態下影響疾病的發生發展。

圖1 TSP1結構及相關功能

1.2 TSP1的功能 腫瘤的發生發展依賴豐富的血液供應,其基礎離不開新生血管的形成。TSP1作為一種抗血管生成因子,在腫瘤疾病中的生物學功能很早便開始受到研究人員的關注。其潛在機制包括抑制內皮細胞的遷移和增殖并誘導內皮細胞凋亡[20]。此外,TSP1的表達受機體原癌基因與抑癌基因的共同調控,在一定程度上影響腫瘤的發生發展過程[3, 10]。既往研究表明,TSP1在諸多良惡性腫瘤疾病中表達水平明顯降低,實驗中通過恢復TSP1的表達水平,可以觀察到腫瘤細胞的生長和遷移等被抑制,包括腎癌[21]、前列腺癌[22]。最新研究表明,TSP1在腫瘤免疫調控中也同樣發揮重要作用[17]。

炎性反應是機體對內外源性損傷作出的防御反應,無論是腫瘤疾病或者非腫瘤疾病,病理狀態下都或多或少存在炎性反應。研究發現,TSP1的N端結構域與細胞膜受體CD36和CD47結合參與炎性反應過程[23]。動物實驗表明,TSP1缺陷小鼠較對照組更易發生急性結腸炎[24]。TSP1在巨噬細胞活化中也具有調控作用,體內實驗證實,抑制TSP1能降低巨噬細胞的炎癥表型,調控方式表現為結合CD36后激活巨噬細胞TLR4通路,此外,TSP1還能刺激NF-kB以及TNF-α的表達增加。有牙周炎疾病模型研究發現,LPS能刺激TSP1表達升高,后者又能同時刺激巨噬細胞產生炎癥因子;在她們后續研究中發現,TSP1通過p38MAPK信號通路介導MMP2、MMP9高表達[25-26]。

TSP1參與細胞外基質重塑過程[27]。在許多纖維化疾病,例如心血管疾病[5, 7]、肝纖維化[28-29]、肺纖維化[30-31],均發現其呈高表達狀態。慢性壓力負荷過載是導致心肌肥厚和心衰的主要原因,TSP1缺陷小鼠早期心肌肥厚和晚期心腔擴大程度比野生型小鼠更為顯著,MMP3、MMP9表達水平增加[7, 32]。Min-DoBartolo等[28]發現TSP1通過調節PPARα信號通路和氨基酸代謝通路介導非酒精性脂肪肝纖維化過程,抑制TSP1能降低α-SMA以及Ⅰ型膠原的表達水平。這些研究數據表明,TSP1是一種潛在抗纖維化治療靶點。

2 TSP1與泌尿系腫瘤

2.1 TSP1與腎透明細胞癌 腎癌在泌尿系腫瘤中發生率很高,病理類型多,常見的包括腎透明細胞癌、乳頭狀細胞癌和嫌色細胞癌,其中腎透明細胞癌最為常見[33]。腎透明細胞癌組織血供非常豐富,提示促血管生成與抗血管生成穩態的失衡,細胞因子水平表現為促血管生成因子表達增加[如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)]及抗血管生成因子(如TSP1)表達降低。作為血管生成抑制因子,TSP1與腫瘤細胞生長、增殖和遷移侵襲等行為聯系密切。既往研究表明,低氧在腫瘤血管生成過程中起著重要作用。低氧誘導VEGF在腎透明細胞癌中表達增加,并抑制TSP1的表達,然而其機制是通過PI3K/AKT信號通路而非缺氧誘導因子(hypoxia inducible facotr,HIF),且這種由低氧導致的低TSP1經由低氧感應器PHDs介導[34]。TSP1對腫瘤的影響受原癌基因和抑癌基因的調控。抑癌基因VHL與腎透明細胞癌關系密切,其編碼的蛋白pVHL在α或β結構域的改變顯著抑制了TSP1表達進而促進腎透明細胞癌細胞遷移和侵襲,而這種調控不是通過與pVHL直接互作產生,且不依賴HIF[35]。p53基因突變存在于絕大多數腫瘤疾病中,包括腎細胞癌,且與VHL基因相互干擾導致DNA損傷[36]。Iubac等[37]通過對腎透明細胞癌臨床樣本的研究,發現TSP1的表達與腎透明細胞癌預后有關,且與p53、微血管密度(microvessel density,MVD)、Ki-67及TNM分期存在負相關性,TSP1是癌癥特異性生存獨立預后因素。這表明TSP1在腎透明細胞癌的發生發展中起著重要作用,影響癌細胞的血管生成、增殖、浸潤。因此TSP1具有作為腎透明細胞癌預后標志物的潛在價值。

2.2 TSP1與膀胱癌 膀胱癌在我國泌尿生殖系統腫瘤中發病率最高[38]。到目前為止,TSP1在膀胱癌中的研究主要集中在腫瘤新生血管生成。無論是淺表的膀胱癌或者浸潤性膀胱癌,均觀察到TSP1的表達水平較正常膀胱組織細胞明顯降低甚至缺乏[39-40]。新生血管的形成這一過程涉及到眾多病理生理改變,包括細胞外基質改變,細胞的增殖、遷移、侵襲、分化等。在膀胱癌發病機制中,新生血管形成是重要環節,該過程中關鍵點是抗血管生成因子TSP1表達降低進而誘導血管新生表型的轉化。在膀胱癌中,TSP1的表達受到p53基因的調節。正常情況下,p53基因產物能促進TSP1表達增加,但在膀胱癌中由于p53基因突變,導致TSP1更易出現表達降低,這一改變又反過來增加了腫瘤微血管生成的可能性[39]。多項臨床研究表明,TSP1是獨立于TNM分期和腫瘤分級的一種預測因素,TSP1在腫瘤細胞中的表達水平與膀胱癌的復發和總體生存率顯著相關,其表達水平越低,腫瘤復發率越高,癌癥患者5年生存率也更低[3, 41]。但也有研究人員發現,TSP1的表達水平與腫瘤的分期、分級及淋巴結轉移等特征不存在相關性[39]。此外,TSP1在腫瘤基質中的表達情況與癌癥分期和分級也呈現出負相關性,在腫瘤基質重塑中發揮調節作用。在癌癥疾病中,TSP1可以抑制MMP9的表達并呈現出強負相關性;另外,TSP1還能抑制MMP2前體活性從而抑制MMP2的表達。其機制可能是在正常狀態下,TSP1調節組織基質金屬蛋白激酶抑制因子(TIMPs)與MMPs之間的平衡,而腫瘤組織中,由于TSP1表達水平發生改變,進而對MMP信號通路及其相關功能產生影響。

2.3 TSP1與前列腺癌 前列腺富含5α還原酶,該酶能將睪酮轉化為作用更強的雙氫睪酮,對雄激素的生成、代謝和轉化起著重要作用,當雙氫睪酮積累過多則會引發前列腺增生或癌變等病理改變。前列腺的生長過程中十分依賴血管生成,無論是良性前列腺增生還是前列腺癌,都能觀察到前列腺組織中血管及相關血管生成因子的含量增加、血管密度增加。前列腺彩超也提示病理組織內血管分支增多,血流速度加快。

前列腺癌的發生發展根本上依賴于新生血管的生成,TSP1是抗血管生成因子,在前列腺癌的進展中具有重要作用。正常的前列腺組織及前列腺增生患者中TSP1均表達增加,而在前列腺上皮內瘤和前列腺癌患者中表達水平卻明顯降低并影響諸多病理特征[42]。其表達水平以及功能狀態受雄激素抑制并呈現出濃度依賴性。體外研究發現,雄激素在正常上皮細胞中維持血管生成活性,但在基質細胞中作用卻相反[43-41]。雄激素能通過調節新生血管的生成從而在一定程度促進控前列腺的生長,其中TSP1發揮著不可忽視的作用。研究表明,相比于腫瘤患者的低TSP1表達水平,接受去勢治療患者中,TSP1表達水平明顯增加[43]。

TSP1發揮抗血管生成作用主要通過激活TGF-β,后者通過抑制正常上皮細胞增殖和促進細胞凋亡及基質分化等從而發揮抑制新生血管生成的作用。前列腺癌早期,TGF-β仍能發揮作用抑制腫瘤進展,但隨著病情的加深,TSP1表達逐漸缺失,這就導致抗血管生成和激活TFG-β這兩個抑制腫瘤進展的屏障被打破,微血管密度增加,在一定程度上提示患者預后不良。也有研究者觀察到TSP1在前列腺癌中表達升高的情況。此外,體內外實驗證實,TSP1還與前列腺癌細胞遷移、增殖和黏附呈負相關性[44-45]。

3 TSP1與泌尿系良性疾病

3.1 TSP1與腎纖維化、糖尿病腎病、急性腎損傷 TGF-β參與ECM的合成和降解,具有很強的致纖維化特性,其介導的功能信號通路在纖維化相關疾病中研究甚廣。TSP1表達于多種細胞類型,在足細胞、小管上皮細胞等均有表達[21, 29, 46-47]。當腎損傷發生后,這些部位均檢測到TSP1表達水平增加,其表達增加程度與腎小管間質纖維化程度呈現正相關性,shRNA抑制TSP1能有效緩解腎小管間質纖維化[48]。腎移植后間質纖維化/小管萎縮(interstitial fibrosis/tubular atrophy, IFTA)患者尿液中TSP1基因表達水平升高,AUC=0.80,能有效區分IFTA患者與正常人[49]。因此,TSP1可作為非侵入性檢查標志物,有望應用于腎臟纖維化類疾病損傷嚴重程度的評估以及療效的評價。

在糖尿病腎病研究中,TSP1/TGF-β/Smad信號通路起著重要作用。無論是Ⅰ型糖尿病還是Ⅱ型糖尿病患者,其TSP1的表達水平均顯著升高,并且與TGF-β/Smad的表達水平呈現正相關性[50-52]。小鼠糖尿病腎病模型研究表明,轉錄因子USF2能誘導TSP1表達增加,并使TGF-β、Ⅰ型膠原表達增加進而加劇糖尿病腎病的發展。USF2與TSP1的相互作用關系在急性腎損傷的研究中也得到證實[53]。

3.2 TSP1與膀胱良性疾病 膀胱組織是一個容量器官,處于反復充盈和排空的狀態,因此與心臟類似,受應力刺激影響較大。常見的如尿道狹窄、膀胱出口梗阻性疾病均會導致排尿期膀胱內壓力增加,長期負荷過載將導致膀胱平滑肌細胞代償性增生、膀胱順應性降低以及膀胱壁纖維化等病理改變,更大的危害則是影響上尿路功能甚至損害腎功能。我們課題組前期研究發現,體外周期性機械應力刺激人膀胱平滑肌細胞能促進增殖反應的發生,SGK1- NFAT2-TRPV1信號通路發揮了重要作用,并能進一步調控膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction,BOO)后的膀胱重塑[54-55]。整合素在應力調控中起著重要的樞紐作用。在傷口愈合研究中發現,αvβ6通過激活TGF-β1和TSP1介導纖維化的快速發生,而抑制αvβ6后觀察到TSP1表達水平降低[56]。此外,周期性機械應力刺激可以促進細胞分泌TSP1,TSP1又直接結合αvβ1誘導蛋白沉積,介導細胞外基質重塑。信號通路TSP1/TGF-β和Thbs1/integrin/YAP已被證實參與這些生物過程的調控[57]。由此可見,TSP1與膀胱病變關系密切。

3.3 TSP1與良性前列腺增生 Doll等[58]提取良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)患者和正常人的前列腺上皮細胞用于體外實驗,發現前列腺增生患者來源的細胞產生的促進血管生成的細胞因子FGF2和VEGF增多,而TSP1表達水平降低,提示TSP1在前列腺增生過程中調控著新生血管的形成。此外,慢性炎癥也是前列腺增生的病理機制之一,在BPH患者前列腺組織樣本中檢測到多種炎癥因子的改變,比如IL-18。在基因和蛋白質水平均檢測到IL-18的高表達,而后作用于前列腺平滑肌使AKT磷酸化,刺激平滑肌細胞產生TSP1促進細胞增殖,最終導致前列腺增生[59]。然而,TSP1表達水平在前列腺增生的研究中出現相反的結果,可能是因為在疾病不同進展階段多種因素共同作用的結果,其具體原因還有待進一步研究。

4 TSP1與藥物治療靶點

由于TSP1具有多結構域的特點,能與多種配體或受體相結合,從而參與不同信號通路的調控,在許多疾病中發揮著重要作用。因此,針對TSP1的拮抗劑和藥物應運而生。LSKL是位于TGF-β LAP上的一段序列,其與TSP1的KRFK序列相結合暴露出受體結合位點,從而激活靜態TGF-β[52, 60]。LSKL肽是一種由LAP-TGF-β衍生而來的四肽,能競爭性抑制TSP1。最新研究結果表明,LSKL處理后可一定程度預防由博萊霉素繼發的肺形態異常改變,降低胰腺導管腺癌細胞的增殖遷移、增加了對化療藥物的敏感性以及促進細胞凋亡。其改善腎間質纖維化的作用也已被驗證。YAO等[61]研究發現,TSP1可以作為抗血管藥物阿帕替尼的作用靶點。RNA和蛋白組測序結果顯示,阿帕替尼處理膠質癌細胞后,TSP1是唯一共同表達降低的基因。通過免疫共沉淀和免疫熒光觀察到TSP1與MYH9共定位并相互作用,且抑制MYH9可以抑制膠質細胞遷移和侵襲即使過表達TSP1。這就提示阿帕替尼能通過THBS1/MYH9軸發揮抗腫瘤血管生成作用。這些研究結果為靶向TSP1治療藥物的研發提供了新的理論依據。

5 結語與展望

泌尿系統作為人體八大生命系統之一,其健康的生理功能是維持生命活動所必需。泌尿系統腫瘤在人類目前所有腫瘤疾病中都占有很高的發生率和死亡率;而前列腺增生、BOO、腎損傷等非腫瘤疾病,嚴重影響患者的生活質量,患者因尿頻、尿失禁等癥狀出現睡眠障礙和抑郁等表現。早期發現并及時有效干預,對挽救患者生命、改善患者生活質量及減少家庭及社會醫療負擔十分有效且必要。因此找尋新的疾病靶點、探究其潛在作用機制并研制新的靶點藥物或老藥新用將為疾病的防治帶來新的出路。

TSP1是重要抗新生血管生成抑制因子之一,因其多結構域多功能特性,在泌尿系腫瘤和非腫瘤疾病中均能介導其發生發展,包括但不限于調節腫瘤微環境、介導腫瘤微血管發生、調節細胞增殖、黏附、遷移侵襲并具有一定程度的腫瘤分期分級及預后診斷價值;作為細胞外基質蛋白,參與細胞外基質重塑的發生發展、與整合素等受體或配體結合參與炎癥、免疫以及纖維化等信號途徑。目前已經有TSP1相關拮抗劑應用于基礎科研領域并證實了其有效性,如LSKL,但目前仍缺少臨床研究。此外,本文中發現TSP1在泌尿系非腫瘤疾病中的研究較腫瘤疾病更少,目前尚缺乏TSP1在膀胱纖維化等膀胱非腫瘤疾病等相關研究,僅查閱到TSP1與之存在間接的關聯。而這些疾病對人類健康的影響不容忽視,因此進一步探究TSP1在膀胱非腫瘤疾病中的作用及潛在機制并尋找可能的防治干預措施將為疾病的防治帶來新的視角和希望。