膽汁酸、腸道菌群與結直腸癌免疫檢查點治療

李天賜, 戚鈞文, 時林森

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)作為最常見的消化道惡性腫瘤之一,在所有惡性腫瘤發病率及死亡率中均居第三位[1]。環境、飲食等后天因素在散發性結直腸癌發生發展中發揮了重要作用,隨著生活方式轉變及飲食結構逐漸西化,結直腸癌發病率在國內有逐年增高的趨勢。膽汁酸作為機體膽固醇代謝衍生物,既往認為其主要參與機體的糖脂代謝及吸收,但現在越來越多的研究發現膽汁酸可通過與核受體(如FXR、TGR5等)的相互作用,調節細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等信號通路,從而影響結直腸癌的發生。同時,膽汁酸還可以作為細胞內和細胞外信號分子,通過調節免疫應答等機制,進一步影響腫瘤微環境和免疫反應。人體消化道共生菌群在膽汁酸水解、次級、三級膽汁酸合成中發揮了重要作用,同時膽汁酸又可以修飾腸道菌群,二者之間存在動態的反饋和平衡。腸道菌群的平衡失調可能導致慢性炎癥、DNA損傷和免疫應答異常,從而增加結直腸癌的風險。

以PD-1,CTLA-4等為代表的免疫檢查點(immune checkpoint inhibitors,ICBs)治療已成為目前臨床及基礎研究的熱點,在CRC中也得到廣泛應用并且在部分患者身上也取得了令人鼓舞的效果。但在臨床應用中仍存在治療反應率偏低、缺乏有效、精準療效預測指標、治療后耐藥等一系列難題。因此,更加深入了解結直腸癌免疫調控的機制和機體自身代謝及免疫系統在ICBs治療中的具體角色,將有助于CRC免疫治療的個體化和精準化。

1 膽汁酸代謝及腸肝循環

膽汁酸作為膽汁主要成分,主要通過細胞色素P450系統通過一系列級聯反應在肝細胞中以膽固醇為底物合成。其中,經典合成通路約占75%左右,其重要產物為膽酸(cholic acid,CA),而改良途徑的產物則為鵝去氧膽酸(chenodeoxy cholic acid,CDCA)[2]。人體膽酸合成后主要與?；撬岷透拾彼峤Y合,形成結合初級膽汁酸,儲存于膽囊。進食后在膽囊收縮素左右下排入十二指腸,參與脂類營養物質的乳化和吸收。在回腸末端,約95%的膽汁酸通過主動和被動吸收入門靜脈系統,通過所謂“腸肝循環”重新回到肝臟,該循環在正常機體每天需要進行6～8次[3],見圖1。約5%的膽汁酸可脫離腸肝循環進入遠端大腸,在膽酸水解酶(bile salt hydrolases,BSH)作用下形成非結合膽酸,然后經腸道菌群羥基類固醇脫氫酶(hydroxysteroid dehydrogenase,HSDH)的脫羥基作用形成次級、三級膽汁酸。迄今為止,共發現人體次級、三級膽汁酸超過100種之多,但主要仍以來源于CA的脫氧膽酸(deoxycholic acid,DCA)和合成自CDCA的石膽酸(lithocholic acid,LCA)為主[4]。次級膽汁酸在大腸仍有少部分可通過被動擴散作用重新進入腸肝循環,但大部分經糞便排出體外。膽汁酸在消化道主要通過其受體如FXR、TGR5、VDR、S1PR2等反饋控制膽酸合成和發揮其小分子信號物質生理作用。

圖1 膽汁酸代謝及肝腸循環[5]

2 膽汁酸與腸道菌群的雙向調控作用

腸道菌群作為一個龐大而復雜的微生態系統,和機體健康和疾病密切相關[5]。腸道菌群可通過水解、脫羥基等作用改變膽汁酸組成。同時,飲食、疾病、藥物等各種外界因素造成的膽汁酸譜改變又可修飾腸道腸道菌群,誘發一系列病理、生理改變。膽汁酸-腸道菌群軸失調在代謝、腫瘤、免疫、感染性疾病中都已得到了證實[6-9]。

膽汁酸對腸道菌群的調控作用主要通過以下途徑來實現:①直接的細胞毒性或細胞結構的復雜改變,如DNA損傷,RNA結構改變,蛋白變性,氧化應激壓力等[10]。這種作用具有菌株特異性,格蘭陽性菌一般較格蘭陰性菌更為敏感;②通過作用于腸黏膜的膽酸受體,如FXR,TGR5等,直接激活機體的初始免疫應答,釋放抗菌多肽,從而改變腸道菌群組成[11]。

腸道菌群對膽汁酸譜同樣具有調控作用,腸道內的腸道菌群具有生物轉化作用,腸道菌群能夠影響膽汁酸代謝相關酶(CYP7a1、CYP7b1、BSH等)的表達,將結合膽汁酸轉化為游離膽汁酸、初級膽汁酸轉為化為次級膽汁酸,進而調控膽汁酸譜[12]。

目前,使用合成膽酸小分子或其他手段來調整腸道菌群,從而治療相關疾病已有相關報道。早在2018年Friedman等[13]就報道了使用膽酸衍生物雌二醇酸可以激活小腸FXR受體,增加腸道格蘭陽性菌如普氏棲糞桿,多氏擬桿菌的豐度,從而實現腸道菌群的人工編輯。Xu等[14]的研究發現DCA可以激活腸道黏膜FXR受體從而改變腸道菌群,誘發小鼠腸道自發炎癥,而FXR拮抗劑可以阻斷這一效應。一項由Tang等[15]發起的橫斷面研究也證實,熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)對原發性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis,PBC)的治療可以提高患者糞便腸道菌群豐度,增加有益菌屬如糞桿菌屬等的比例,從而緩解膽管的局部炎癥。

3 膽汁酸、腸道菌群紊亂與結直腸癌

2013年,由Ou等[16]完成的調查性研究表結果顯示,高纖維、低脂肪飲食為主的非洲土著人(CRC發病率<5/100 000)與高脂、低纖飲食的非裔美國人(CRC發病率約 65/100 000)相比,腸道菌群多樣性明顯高于后者,而后者糞便次級膽汁酸水平明顯高于前者。從而證實,腸道菌群衍生的次級膽汁酸在CRC發病中發揮著重要作用。最近的一項回顧性隊列研究結果也表明,血清膽汁酸中結合膽汁酸水平和CRC發病率正相關,但游離膽汁酸無明顯相關性[17]。但Sinha等[18]的研究結果卻表明,潰瘍性結腸炎患者術后腸道合成次級膽酸的相關菌群數量降低,可誘導儲袋炎的發生,這可能和原有基礎疾病和所用研究模型不同有關。

長期高脂、高蛋白、低纖維飲食可刺激肝臟膽酸合成,大量初級膽汁酸進入腸道后又通過直接或間接的菌群修飾作用,導致腸道含7α-脫羥基酶的菌群相對增多,產生大量次級膽汁酸,特別是DCA和CDCA,從而誘發腸黏膜的慢性炎癥和CRC的發生[19-20]。眾所周知,美國阿拉斯加原住民擁有世界上最高的CRC發病率,約91/100 00,一項針對該人口的橫斷面研究證實,阿拉斯加原住民較健康對照腸道菌群中具有7α-脫羥基酶的布勞特氏和藍綠藻菌屬豐度明顯增多,糞便中DCA濃度也顯著增高[21]。

Dermadi等通過長期給予小鼠西式飲食后發現,黏膜膽汁酸代謝紊亂和FXR受體的失活可促進黏膜癌變和結腸腫瘤細胞的增殖[22]。Fu等[23]的研究進一步證實,飲食因素導致的WNT通路失調(APC基因突變)可以改變腸道膽汁酸譜,增高的次級膽酸如DCA等可沉默PXR受體,促進Lgr5+的結腸癌干細胞增殖和DNA損傷。吸煙作為CRC的高危因素之一,同樣被證實其可引起腸道菌群失調,包括緩慢愛格士氏菌增多,狄氏副擬桿菌和乳酸桿菌減少,進而合成牛璜脫氧膽酸(taurodeoxycholic acid,TDCA)增多,最終激活MAPK/ERK通路和破壞腸黏膜屏障功能[24]。但是,不同膽酸對腸上皮的作用具有特異性,例如牛璜熊去氧膽酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)就被證實可抑制CRC細胞NF-κB通路的激活,減少炎癥因子釋放,因此可以做為CRC的潛在治療選擇[25]。

腸道菌群作為腸黏膜生物屏障的主體,在正常腸黏膜生理功能維持、病理狀態如炎癥、損傷、癌變的過程中發揮的重要作用已得到公認,無需贅述。而腸道菌群及其代謝產物如膽酸,短鏈脂肪酸等,也可修飾腸道的局部免疫微環境,影響CRC的發生。調節性T細胞(Treg)是維持黏膜免疫穩態的重要細胞亞群,消化道膽汁酸可通過膽酸受體尤其是VDR來維持 RORγ+Treg的穩態。LCA的兩種重要衍生物,3-oxoLCA可抑制Th17分化,而isoalloLCA則促進Treg細胞分化,口服該化合物的小鼠免疫應答受到明顯抑制[26-27]。相反,DCA衍生物3β-羥基脫氧膽酸(isoDCA),則可以通過DC細胞來誘導FoxP3分化,從而增強其免疫抑制功能[28]。同時,DCA可引起腸黏膜局部巨噬細胞的富集和M2極化,促進炎癥因子的釋放,同時減少免疫球蛋白sIGA分泌,降低腸道的免疫屏障和對病原體的防御功能[29]。

4 膽汁酸、腸道菌群調整與結直腸癌免疫治療

腫瘤免疫治療成功的關鍵在于破除局部免疫抑制微環境(tumor microenvironment,TME),重新激活機體的抗腫瘤免疫系統。腸道菌群及其代謝產物,在CRC局部免疫TME的構成中,也發揮了舉足輕重的作用[30]。早在2013年,Iida等[31]就率先證實了腸道菌群失調可以通過增強腫瘤TME中髓系來源抑制細胞功能,從而影響CpG寡核苷酸免疫療法在CRC中的治療效果。在2015年,ICBs抑制劑問世不久,Marie等[32]就發現了CTLA-4靶向藥物療效和腸道共生菌,尤其是脆弱擬桿菌和多形擬桿菌密切相關,而在抗生素預處理或無菌小鼠幾乎無效,從而證實了腸道菌群在ICBs治療中的重要作用。

關于腸道菌群重塑腫瘤局部TME,影響ICBs治療的具體機制,目前為止遠未完全闡明。該領域已經引起相關學者的高度興趣,大量的研究結果也在近期不斷發表。主要理論大概有以下幾種:①通過腸道菌群調整,可以改變腫瘤中效應/抑制淋巴細胞比例,形成抗腫瘤的局部TME[33];②菌群抗原通過APC的遞呈促進DC細胞的活化,經過細胞因子的釋放,最終激活TME中效應T細胞,如CD8+T細胞,腫瘤特異性CD4+T細胞等,增強TH1抗腫瘤免疫[34-35]。③通過其代謝產物,如膽酸、短鏈脂肪酸,肌酐等,直接作用于免疫細胞,進而影響其功能[36-38]。

傳統的腸道菌群修飾技術如益生菌、抗生素、營養、飲食調整等,雖廣泛使用,但存在療效不可靠、無法量化、欠缺精準性等缺點。近年來,以標準化糞菌移植(fecal microbiota transplants,FMT),特異性菌株分離和純化技術的不斷興起和成熟,使腸道菌群的個體化、標準化人工編輯成為可能[39]。目前Clinical trials注冊的關于FMT和腫瘤ICBs治療相關臨床研究共7項(NCT05273255、NCT04729322、NCT05279677、NCT04130763、NCT04758507、NCT05251389、NCT04577729)(表1)。期待更多的高質量隨機對照研究結果能為臨床提供更高級別證據。

表1 正在進行的關于FMT聯合腫瘤免疫檢查點治療的相關臨床研究

雖然已有不少的研究報道了FMT聯合免疫治療能夠明顯影響腫瘤患者對抗腫瘤免疫療法的反應,但是糞便中何種成分帶來FMT療法的成功尚未得到澄清。因此驗證糞便中各種成分獨立的作用機制可能為FTM聯合免疫治療提供新的治療方案。

益生菌和益生元等菌群調控制劑聯合免疫治療可能會增加ICBs的療效,進而提高腫瘤免疫治療的反應性[40]。盡管益生菌聯合免疫治療在結直腸癌的臨床治療中少有報告,但Dizman等[41]在一項臨床試驗中發現予轉移性腎細胞癌患者納武利單抗+伊匹木單抗治療的時候,輔以益生菌口服藥物CBM588來聯合治療,能極大地改善中位無進展生存期。因此菌群調控制劑聯合免疫治療在CRC的具體作用和效果值得進一步開展系統、多中心、隨機對照的臨床試驗。

關于腸道菌群修飾和CRC的ICBs治療,多項研究已經進行了相關報道。Zhang等[42]將小鼠腸道菌群使用廣譜抗生素進行清除后,FMT植入CRC患者菌群能使PD-1治療療效減低,而植入健康捐獻者糞便菌群聯合膳食纖維能明顯增強PD-1治療反應,其機制可能是通過增加腫瘤TME中CD8+T細胞浸潤和功能。同時,腸道菌群紊亂造成的3型天然淋巴細胞(ILC3)減少和比例失調,是造成PD-1治療在CRC耐藥的原因之一[43]。L.paracasei sh2020作為人工分離純化的乳桿菌菌株,在小鼠體內可以明顯增加腫瘤TME中效應T細胞浸潤,增強PD-1治療反應[44]。目前,關于膽酸和CRC免疫檢查點治療的相關研究較少,但在其他疾病,如肝癌中已有相關報道[45]。

5 總結及展望

腫瘤的免疫治療在近年來得到了前所未有的重視和快速地發展,先是在黑色素瘤、淋巴瘤等病種中取得了巨大成功,而后又逐漸擴展到消化道、婦科、呼吸道腫瘤等領域。CRC作為一種炎癥相關性腫瘤,長期的慢性炎癥導致的局部免疫抑制TME和腫瘤細胞免疫逃逸是CRC發生、發展的重要原因之一[46]。自2017年FDA正式批準PD-1單抗作為轉移性微衛星不穩定型(microsatellite high,MSI-H)CRC的一線治療以來[47],腫瘤的ICBs在CRC治療中正式由“幕后”走向“臺前”,吸引了越來越多的目光。KEYNOTE-177更進一步證實了PD-1單抗較化療在MSI-H 轉移性CRC中具有更高的治療反應率(83%vs.35%)和更長的無進展生存期(16.5個月vs.8.2個月)[48]。

即使ICBs治療在MSI-H亞型CRC中取得了令人鼓舞的結果,但仍然面臨不小的壓力和挑戰。畢竟MSI-H亞型在所有散發性CRC中只占15%左右,剩余的大部分MSI-L亞型CRC患者如何從免疫治療中獲益?即使在MSI-H中,仍有約29.4%的患者在PD-1治療中疾病進展[49],因此CRC的ICBs治療方案仍有很大的優化空間,亟待更好的分子標志物和療效預測的指標;更好地理解CRC免疫抑制TME中免疫細胞的功能變化及調控網絡,乃至提出可行的TME修飾策略,如借助腸道菌群及其代謝產物,將會是治療成功的關鍵[50]。

在全世界的眾多科學家都將目光聚集并且投身于腫瘤免疫治療的巨大工程中,我們所經歷的可能是腫瘤治療史上一次偉大的變革。面對中國日益增長的CRC病例,國內的結直腸外科及腫瘤醫師如何在基礎理論及臨床科研領域發出自己的聲音,努力成為CRC免疫治療賽道的“領跑者”,將是我們不懈努力的方向和目標。