甲狀腺癌中含伴侶蛋白的TCP1亞基3表達與生物學行為及免疫微環境的關系研究

白云峰, 施曉輝, 白銀寶, 塔拉

甲狀腺癌是成人最常見的內分泌惡性腫瘤,其中甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer, PTC)是甲狀腺癌中最常見的亞型[1],約占全部甲狀腺癌的85%～90%,且其發病率逐年增加,已成為頭頸外科最常見的惡性腫瘤之一[2]。盡管大多數PTC患者可通過外科手術和放射性碘131輔助治療后治愈,但仍有部分PTC進展為難治性的癌癥,易復發、轉移[3-5]。因此,需要從發生發展機制及預后等方面對其進行深入研究,其中導致絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K/AKT)信號通路激活的突變至關重要[6]。甲狀腺癌中最常見的突變是抗鼠科肉瘤病毒癌基因同源物B1(BRAF)突變、端粒酶逆轉錄酶(TERT)啟動子突變、RAS和RET重排等[6-7]。TCP1復合物伴侶蛋白(chaperonin containing TCP1complex,CCT)是真核細胞胞質中唯一的伴侶素分子,參與約10%的蛋白質折疊,由2個異寡聚體堆疊環組成,每個環由8個不同的亞基(CCT1～CCT8)構成[8]。含有TCP1伴侶蛋白亞基3(Chaperonin containing TCP1,subunit 3,CCT3)是CCT家族中的一個重要亞基,有研究表明其在一些腫瘤中高表達,并且與腫瘤的發生發展和預后關系密切[9-13]。CCT3參與腫瘤發病近幾年被廣為報道[14]。Liu等[10]認為CCT3與甲胎蛋白(AFP)聯合可以增加肝癌診斷的陽性率,尤其對于AFP陰性肝癌和早期肝癌時,CCT3還可以在YAP和TFCP2的上游起作用,靶向CCT3可能治療YAP相關肝癌。在肺腺癌中,CCT3通過激活JAK2/STAT3通路促進肺腺癌細胞對順鉑的耐藥性[13]。但關于CCT3在甲狀腺癌中的報道甚少。本研究通過TCGA數據庫分析CCT3與甲狀腺癌的關系,通過臨床樣本和體外實驗驗證其生物學行為,然后通過GSEA富集分析和CIBERSORT分析可能相關信號通路、腫瘤微環境免疫相關及機制,探討其可能成為新的分子標志物及治療靶點的價值。

1 資料與方法

1.1 TCGA數據庫 從UCSC xena癌癥基因組圖譜庫(https://xenabrowser.net/)下載獲取33種腫瘤的癌組織(9184例)和癌旁組織(8260例)的CCT3表達數據,利用R.4.3.1軟件分析CCT3在泛癌中的表達差異。使用R軟件利用“TCGAbiolinks”R包從TCGA數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載甲狀腺癌數據,進行數據整理,采用“Limma”R包進行差異分析,采用“ggplot”R包進行可視化。

1.2 臨床樣本 納入2022年3—5月內蒙古自治區人民醫院收治的30例PTC患者,手術時患者的年齡44(26～65)歲。取其癌組織,以及距腫瘤邊緣>2 cm處的癌旁正常組織。本研究經內蒙古自治區人民醫院倫理委員會批準。

1.3 免疫組織化學染色法(IHC)檢測PTC組織及癌旁組織中CCT3的表達 將30對PTC組織及癌旁組織用甲醛固定、石蠟包埋,4～5 μm切片,通過烘干、在二甲苯中脫蠟和酒精遞減中復水,在枸櫞酸緩沖液中抗原修復20 min;將切片冷卻至室溫后,在雙蒸水中孵育10 min,加入10%山羊血清繼續孵育30 min。加入CCT3抗體(1∶50),4 ℃冰箱孵育過夜。1×TBS緩沖液漂洗3次,加入1∶200稀釋的辣根過氧化物酶(二抗抗體),室溫孵育1 h。再次洗滌,固紅顯色試劑盒顯色,室溫孵育15 min,顯色,閱片。標本免疫組織化學染色結果以CCT3染色強度和陽性率來評判,染色強度分為4個等級:0為陰性表達,無色;1為低表達,淡黃色;2為中等表達,棕黃色;3為高表達,褐色。陽性率:0分為陰性;1分為1%～25%;2分為26%～50%;3分為51%～75%;4分為76%～100%。將兩個評分的乘積作為每個標本的染色評分結果。此部分由兩名病理學醫師獨立評估,其對臨床數據均不知情。

1.4 細胞培養 K1細胞系是一種PTC細胞混合細胞系,來源于歐洲標準細胞收藏中心(European Collection of Authenticated Cell Cultures,ECACC)。B-CPAP細胞來自中國科學院細胞庫。K1細胞系和B-CPAP均培養在DMEM-F12培養基中,其中添加10%胎牛血清以及1%青霉素(終濃度:100 U/mL),鏈霉素(終濃度:100 U/mL),培養在5% CO2、37℃恒溫、恒濕的細胞培養箱中。取對數生長期細胞接種于6孔板中6×105個/孔,培養至75%的密度左右時進行轉染。

1.5 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測PTC細胞中CCT3 mRNA的表達 為研究CCT3在PTC發生發展中的作用,本研究在PTC細胞中敲低CCT3,并研究CCT3的細胞功能。比較兩種細胞株(K1細胞系和B-CPAP細胞系)中CCT3 mRNA的表達水平。使用TRIzol試劑(美國Thermo Fisher Scientific公司)提取細胞中的總RNA,并檢測其純度。使用M-MLV逆轉錄酶(北京Promega生物技術有限公司)將總RNA反轉錄為cDNA。以GAPDH作為內參。RT-qPCR擴增參數參照SYBR Advantage qPCR Premix試劑盒(日本TaKaRa公司)說明書操作,以cDNA為模板進行RT-qPCR。參數:95 ℃預變性30 s;95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、45次循環;60 ℃終延伸30 s。使用2-ΔΔCt方法計算CCT3 mRNA的相對表達量。CCT3引物:正向5′-TCA GTC GGT GGT CAT CTT TGG-3′。反向5′-CCT CCA GGT ATC TTT TCC ACT CT-3′,GAPDH引物:正向5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′,反向5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。

1.6 慢病毒感染 將K1細胞用CCT3為靶點的慢病毒感染,分為對照組(正常培養,shCtrl)和干擾組(轉染CCT3特異性shRNA,shCCT3)。通過熒光顯微鏡觀察感染慢病毒72 h后K1細胞表達綠色熒光蛋白(GFP)的感染效果,將細胞分為對照組(正常培養,shCtrl)和干擾組(轉染CCT3特異性shRNA,shCCT3)。CCT3shRNA慢病毒購于上海吉凱基因醫學科技股份有限公司。CCT3 shRNA的靶序列:5′-CAAGTCCATGATCGAAAT T-3′;非沉默對照的靶序列:5′-GCGTCCTCATACCAGGATAAA-3′。

1.7 蛋白免疫印記(Western Blot)檢測PTC細胞中CCT3蛋白的表達 收集shCtrl組和shCCT3組的K1細胞,用細胞裂解液裂解后,提取細胞中總蛋白。使用PierceTMBCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)測定蛋白濃度,按每孔上樣量60 μg進行SDS-PAGE,穩壓冰浴電轉至PVDF膜上,5%牛血清白蛋白封閉2 h,加入一抗后[CCT3一抗為兔抗人多克隆抗體(英國Abcam公司),稀釋度為1∶500;內參GAPDH一抗為兔抗人單克隆抗體(美國CST公司),稀釋度為1∶2000],4 ℃孵育過夜。再加入二抗[辣根過氧化物酶標記的鼠抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司),稀釋度為1∶2000],使用PierceTMECL試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)發光并采集圖片數據,計算蛋白相對表達量。

1.8 高含量篩選(HCS)和MTT法檢測細胞增殖 為研究沉默CCT3對PTC細胞生長的影響,將shCCT3組和shCtrl組的PTCK1細胞以等密度接種到96孔板中。培養5 d,每天測定細胞數量。將干擾組和對照組細胞在37 ℃、5%CO2的培養箱中培養。取對數生長期細胞,按每孔100 μl接種于96孔培養板中。鋪板后24 h,使用Array ScanTMHCS 2.0軟件(美國Thermo Fisher Scientific公司)采集并量化細胞圖像,連續5 d。然后加入20 μL MTT溶液(5 g/L),繼續培養4 h,吸棄孔中細胞上清。每孔加入100 μl二甲基亞砜,使用振蕩器振蕩10 min,在酶標儀上于490 nm波長處測量各孔的光密度(OD)值。

1.9 流式細胞技術檢測細胞凋亡 采用Annexin V-Allophycocyanin (APC)凋亡檢測試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)分析細胞凋亡情況:取處于對數生長期的兩組細胞。消化、收集,用預冷的PBS洗細胞2次。將細胞密度調整為(1×106～1×107)/mL。然后加入5 μL APC熒光標記的Annexin V試劑,室溫孵育15 min。在流式細胞儀上檢測細胞凋亡率。

1.10 流式細胞技術檢測細胞周期 為研究沉默CCT3抑制PTC細胞增殖的機制,檢測了敲低CCT3后K1的細胞周期分布。shCCT 3和shCtrl慢病毒感染96 h后,用碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色并通過流式細胞術分析。取對數生長期的兩組細胞,在6孔板中培養。孵育96 h,細胞生長至覆蓋率約80%,吸棄上清,用70%乙醇固定,于4%CO2、37 ℃恒溫箱中過夜。PBS洗滌2次,并用10 mg/mL RNA酶溶液在37 ℃下行細胞PI染色。最后使用流式細胞儀和BD FACStationTM6.1軟件進行數據分析。

1.11 GSEA富集分析 為確定CCT3在甲狀腺癌中可能參與的信號通路,將CCT3分為高表達組和低表達組進行GSEA富集分析,使用TCGA數據庫,以MsigDB中的H(h.all.v7.0.symbols.gmt)和C7(c7.all.v7.0.symbols.gmt)數據集作為功能基因集。利用GSEA分析,隨機組合次數設置為1000次,以P<0.05為基因集顯著富集。

1.12 CIBERSORT免疫細胞浸潤差異和相關性分析 將下載的基因表達矩陣進行歸一化和整理,采用CIBERSORT法分析甲狀腺癌中22種免疫細胞的豐度,再將CCT3以中位數分高、低表達組,分析在甲狀腺癌中與22種免疫細胞的差異,最后將每個免疫細胞與CCT3進行相關性分析。22種免疫細胞包括:未成熟的B細胞(B cells naive);記憶B細胞(B cells memory);漿細胞(plasma cells);CD8+T細胞(T cells CD8);未成熟的CD4+T細胞(T cells CD4 naive);靜息記憶CD4+T細胞(T cells CD4 memory resting);活化記憶CD4+T細胞(T cells CD4 memory activated);濾泡輔助性T細胞(T cells follicular helper);濾泡調節性T細胞(T cells regulatory Tregs);γδT細胞(T cells gamma delta);靜息NK細胞(NK cells resting);活化NK細胞(NK cells activated);單核細胞(moncytes);巨噬細胞M0(macrophages M0);巨噬細胞M1(macrophages M1);巨噬細胞M2(macrophages M2);靜息樹突細胞(dendritic cells resting);活化樹突細胞(dendritic cells activated);靜息肥大細胞(mast cells resting);活化肥大細胞(mast cells activated);嗜酸性粒細胞(eosinophils);中性粒細胞(neutrophils)。

1.13 統計學方法 使用SPSS 22.0和R軟件4.3.1版本進行統計分析。實驗指標以均值±標準差表示,兩組間的差異比較采用t檢驗,多組間差異比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CCT3在人PTC中高表達 UCSC xena癌癥基因組圖譜庫結果顯示,CCT3在28種癌癥中高表達,即卵巢癌(OV)、子宮癌肉瘤(UCS)、子宮內膜樣癌(UCEC)、乳腺浸潤癌(BRCA)、多形成性膠質細胞瘤(GBM)、腦低級別膠質瘤(LGG)、腎上腺皮質癌(ACC)、甲狀腺癌(THCA)、肺腺癌(LUAD)、肺鱗狀細胞癌(LUSC)、胰腺癌(PAAD)、食管癌(ESCA)、胃癌(STAD)、皮膚黑色素瘤(SKCM)、結腸癌(COAD)、直腸癌(READ)、前列腺癌(PRAD)、睪丸癌(TGCT)、胸腺瘤(THYM)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBC)、肝癌(LIHC)、腎乳頭狀細胞癌(KIRP)、膀胱尿路上皮癌(BLCA)、宮頸鱗癌和腺癌(CESC)、肉瘤(SARC)、膽管癌(CHOL)、頭頸癌(HNSC)、嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤(PCPG)。在腎嫌色細胞癌(KICH)中低表達,見圖1A。選擇TCGA數據庫中500例甲狀腺癌組織與57例癌旁正常組織樣本對比,發現CCT3在甲狀腺癌腫瘤組織中的表達量明顯高于癌旁正常組織,見圖1B。

圖1 CCT3在泛癌及甲狀腺癌中的表達情況 1A:UCSCxena數據庫分析CCT3在泛癌中的表達差異;1B:TCGA數據庫中CCT3在甲狀腺癌組織與癌旁正常組織中的表達差異

2.2 CCT3在PTC中高表達 CCT3在癌旁正常組織中染色很少,而在PTC的細胞核及胞質中染色較多(圖2A)。CCT3在癌組織中的染色評分明顯高于癌旁正常組織(圖2B)。

圖2 CCT3在人甲狀腺乳頭狀癌中過表達 2A:IHC染色檢測癌旁正常組織和PTC組織中CCT3表達情況;2B:癌旁正常組織與PTC組織中CCT3表達評分比較(n=30,***P<0.001)

2.3 CCT3在PTC中被有效沉默 CCT3 mRNA在兩種細胞系中表達量均較高,其中K1細胞中CCT3 mRNA水平相對高于B-CPAP細胞(圖3A)。因此,本研究對K1細胞進行CCT3的敲減,進行下游實驗發現,shCCT3組和shCtrl組中80%以上的K1細胞被成功感染(圖3B)。RT-qPCR結果表明,shCCT3組的CCT3 mRNA表達量約為shCtrl組的10%(圖3C)。Western Blot結果顯示,shCCT3慢病毒感染后,K1細胞中CCT3蛋白表達水平低于shCtrl組(圖3D)。表明在K1細胞中使用慢病毒成功敲低了CCT3。

圖3 人PTC中CCT3的敲低 3A:K1和B-CPAP細胞中的CCT3表達水平比較;3B:慢病毒感染K1細胞后72 h的感染效率(×200);3C:shCtrl與shCCT3組K1細胞中的CCT3 mRNA水平比較(n=3,**P<0.01);3D:shCtrl組和shCCT3組K1細胞CCT3蛋白表達

圖4 敲低CCT3可抑制PTC細胞的增殖 4A:慢病毒感染后細胞生長的代表性熒光顯微鏡圖像;4B:感染后shCtrl和shCCT3組細胞計數比較(n=3);4C:MTT試驗測定shCtrl和shCCT3組細胞活性,*P<0.01。

2.4 沉默CCT3抑制PTC細胞的增殖 熒光顯微鏡觀察到shCCT3組和shCtrl組細胞在前2天的綠色熒光蛋白(GFP)表達細胞相當。從第3天開始,shCCT3組細胞的GFP密度低于shCtrl組細胞(圖4A)。細胞計數結果證實,培養第5天時,shCtrl組的細胞逐漸增多,而shCCT3的細胞逐漸減少(圖4B)。MTT結果顯示,shCtrl組的細胞在5天內穩定生長;前2天shCCT3組的細胞存活數與shCtrl組相似,但此后shCCT3組的細胞生長率顯著降低(圖4C)。

2.5 沉默CCT3影響細胞周期進程 shCCT3組中G1期和S期細胞比例低于shCtrl K1組,而shCCT3 K1細胞中G2/M期細胞比例高于shCtrlK1細胞(圖5)。

圖5 沉默CCT3基因影響細胞周期檢測結果 5A:流式細胞儀分析每組K1細胞的細胞周期分布;5B:shCtrl與shCCT3組K1細胞的細胞周期分布情況; **P<0.01

2.6 沉默CCT3可誘導細胞凋亡 與shCtrl K1細胞相比,shCCT3 K1細胞的凋亡細胞比例增加了近4倍(圖6)。

圖6 沉默CCT3可誘導細胞凋亡 6A:Annexin V染色顯示細胞凋亡情況;6B:shCtrl與shCCT3組細胞凋亡率比較(n=3,***P<0.001)

2.7 GSEA基因富集分析結果 CCT3主要參與了11條信號通路,包括:同種異體移植物排斥、γ干擾素應答、炎性反應、補體、IL-6-JAK-STAT3信號、α干擾素應答、KRAS信號、IL-2-STATS信號、氧化磷酸化通路、通過NF-κB的TNFA信號、凝血等免疫相關通路,見圖7。

圖7 GSEA富集分析CCT3在甲狀腺癌中參與的通路 7A:“H” 基因集(多個已知的基因集構成的超基因集);7B:“C7”基因集(免疫系統功能相關的基因集合)

2.8 CIBERSORT法分析免疫細胞浸潤相關性 為進一步分析免疫機制在甲狀腺癌微環境中的影響,利用CIBERSORT法推斷甲狀腺癌和正常甲狀腺中22種免疫細胞的表達豐度,見圖8A。然后將CCT3分為高、低表達組,采用CIBERSORT法分析甲狀腺癌中22種免疫細胞的表達差異,結果顯示7種免疫細胞在CCT3基因高表達組與低表達組中具有統計學差異,分別是記憶B細胞、漿細胞、活化記憶CD4+T細胞、巨噬細胞M1、巨噬細胞M2、靜息肥大細胞和嗜酸性粒細胞,見圖8B。在每個免疫細胞與CCT3的相關性分析中,記憶B細胞、靜息NK細胞、巨噬細胞M2、靜息肥大細胞、中性粒細胞與CCT3呈正相關。漿細胞、活化記憶CD4+T細胞、巨噬細胞M1與CCT3呈負相關,見圖8C。

圖8 CIBERSORT免疫細胞相關性分析 8A:甲狀腺癌中22種免疫細胞豐度柱狀圖;8B:甲狀腺中CCT3與22種免疫細胞的差異箱線圖;8C:甲狀腺癌中CCT3與每個免疫細胞的相關性散點圖;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

3 討論

目前用于治療復發的、轉移的、難治性甲狀腺癌的藥物有索拉非尼[15]和Lenvatinib[16]等,這兩種藥物為多靶點抑制劑,不良反應特別強,對于難治性PTC缺乏特異性強的治療靶點[17]。其發病機制、分子靶點、預后評估是目前研究的重點。本研究發現,CCT3在PTC組織中的表達顯著高于癌旁正常組織。此外,沉默CCT3可降低K1細胞的增殖和細胞周期進程,并誘導細胞凋亡。并且CCT3在甲狀腺癌中可能通過參與IL-6-JAK-STAT3信號通路、NF-κB信號通路、KRAS信號通路和免疫相關信號通路。

CCT3是CCT家族的重要亞基之一。CCT屬于Ⅱ型伴侶素,作為一種伴侶蛋白復合物,參與細胞中10%的蛋白質折疊,調節許多腫瘤相關蛋白質的表達和細胞周期[18]。除了包括肌動蛋白和微管蛋白在內的細胞骨架蛋白,一些細胞周期調節蛋白,如細胞周期因子20(Cdc20p)、鈣黏蛋白1(Cdh1p)、馬球象激酶1(Plk1)和細胞周期蛋白E(cyclin E)、細胞周期蛋白B(cyclin B)、VHL腫瘤抑制蛋白、肌球蛋白、P53、KRAS、p21ras、轉錄激活因子3(STAT3)、轉導蛋白和含有WD重復序列的蛋白質家族成員等,也是CCT的底物[19-21]。CCT表達異常影響細胞的侵襲和轉移[18]。有研究表明CCT3在肝癌、胃癌、結直腸癌、卵巢癌等多種腫瘤中高表達,并且與增殖、侵襲、轉移及復發等相關[9-11,22]。本研究采用生物信息學分析對TCGA數據庫進行挖掘,發現CCT3在多種癌中均高表達,并且在甲狀腺癌中的表達顯著上調,與上述報道結果一致。本研究成功地在K1細胞中沉默了CCT3,發現沉默CCT3能明顯降低K1細胞的增殖和細胞周期進展。在CCT3沉默的K1細胞中觀察到細胞周期阻滯在G2/M期,并伴有G1期和S期分布的減少。已知DNA損傷檢查點是G2/M期阻滯的顯著因素,這表明沉默CCT3可導致DNA功能失調,從而阻止有絲分裂。有研究證明敲低CCT3可以提高肝細胞癌對長春新堿治療的敏感性[23]。本研究觀察到沉默CCT3可誘導K1細胞凋亡。此外,沉默CCT3后G2/M周期阻滯增強也可導致細胞凋亡增加。因此,CCT3可能對PTC細胞存活和增殖至關重要。最新研究稱CCT3聯合AFP可增加早期肝癌及AFP陰性時的肝癌診斷率,且靶向CCT3干擾可能治療YAP相關肝癌[10]。還有報道稱,CCT3可能成為肺腺癌產生順鉑耐藥性的治療靶點[13]。本研究發現,CCT3表達增加與PTC的腫瘤面積有關。沉默CCT3降低了PTC細胞的增殖。利用GSEA富集分析發現,CCT3通過多種基因集參與甲狀腺癌的發生發展,如同種異體移植物排斥、γ干擾素應答、炎癥反應、補體、IL-6-JAK-STAT3信號通路、α干擾素應答、KRAS信號-上調、IL-2-STATS信號、氧化磷酸化通路、通過NF-κB的TNFA信號、凝血等免疫相關通路。有報道表明,RAS、JAK-STAT3、NF-κB與甲狀腺癌的發生、發展密切相關[24-26],在其他癌中CCT3通過JAK-STAT3信號通路促進多發性骨髓瘤的進展[27],在一項挽救實驗中NF-κB-p65的過表達挽救了乳腺癌細胞中受CCT3影響的細胞增殖和遷移[12]。并且免疫細胞在PTC腫瘤的微環境中起促進或抗腫瘤作用[28]。以上結果提示,CCT3可能是一種有價值的用于診斷PTC的生物標志物和潛在分子治療靶點。

綜上所述,CCT3在PTC組織中高表達,CCT3參與了PTC的發病機制,CCT3是PTC的致癌基因,CCT3可能通過調節免疫細胞在甲狀腺癌微環境中發揮作用,其機制還需進一步研究。CCT3可能成為PTC分子診斷和治療的潛在候選基因。本研究仍存在不足之處,數據分析未聯合多個數據庫進行聯合驗證,另外關于CCT3如何通過上述信號通路及免疫反應通路影響甲狀腺癌的發生發展尚需深入研究。