IL-6對小鼠胚胎心肌細胞增殖能力的影響及發育依賴性變化*

顧浩南, 王 淇, 孫惠美, 周 易, 梁華敏△

1華中科技大學基礎醫學院生理學系,湖北省藥物靶點和藥效學評價重點實驗室,武漢 430030 2華中科技大學基礎醫學國家級實驗教學示范中心,武漢 430030

近年來,諸多研究發現成年動物心臟仍然具有一定的心肌更新即分裂增殖[1-4],心肌再生科學研究的最重大突破是基本確立成年動物新生心肌細胞的確切來源。利用cre轉基因老鼠準確追蹤新生心肌細胞的來源,發現已經存在的心肌細胞是哺乳動物發育過程中或急性心梗后心肌再生的確切來源[2,4-6]。已經發現,哺乳動物發育過程中心肌細胞增殖能力逐漸下降,并伴隨著心肌細胞核倍型的變化[7]:在哺乳動物出生后,具有增殖能力的單核二倍體心肌細胞伴隨著血壓或電生理學特點的變化逐漸發生多核/多倍體化,同時逐漸失去增殖能力。

心梗后心肌細胞增殖能力增強[8-9],而IL-6是心臟微環境中重要的細胞因子之一。已有研究發現,IL-6可上調新生鼠心肌細胞的增殖能力而促進新生鼠急性心梗后的心功能修復[10]。IL-6主要作用模式是和靶細胞膜受體或血液/組織液中可溶性受體結合后,進一步通過靶細胞膜表面的gp130蛋白激活JAK-STAT3、SHP2-RAS-ERK和PI3K-Akt信號轉導系統,從而發揮生物學作用[11-13]。研究發現gp130蛋白激活不僅影響青春期和成年小鼠的心肌增殖,也影響急性心梗后的心肌細胞再生[14]。本課題組前期研究發現,小鼠個體發育過程中心臟內IL-6的濃度發生變化[15],并且哺乳動物心肌細胞類型以及增殖能力也在發生動態變化[7-8]。這些變化是否會影響IL-6對內源性心肌再生的作用仍需要進一步研究。

本課題旨在探討IL-6對小鼠胚胎發育過程中心肌細胞增殖能力的影響,分析可能的發育依賴性變化及濃度性依賴性變化。這些研究結果不僅為心肌細胞的發育研究增加新的內容,也為探索成年動物急性心梗后內環境對內源性心肌再生影響提供線索,為有效激活內源性心肌細胞再生治療心臟疾病提供新思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 胚胎心肌細胞的分離與培養

6～8周齡的C57BL/6雌性小鼠(華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供)以2∶1比例和雄性小鼠合籠一夜,第2天早上若受孕,則胚胎被記為0.5 d(embryonic day 0.5,E0.5)。胚胎發育早期(EDS,E10.5～E12.5)和發育晚期(LDS,E16.5～E18.5)的胚胎小鼠的心臟組織剪碎后于37℃恒溫條件下在膠原酶Collagenase B solution(1 mg/mL,Roche,德國)中孵育20～25 min以獲得單個細胞。心肌細胞在20%DMEM培養液中培養24 h后分別在培養液中加入10 ng/mL和50 ng/mL IL-6(Peprotech,美國)處理24 h。20% DMEM(100 mL)含有20 mL胎牛血清(Gibco,美國)和80 mL DMEM(Gibco,美國)。

1.2 免疫熒光技術檢測心肌細胞增殖能力

在IL-6處理心肌細胞的同時,在培養液中添加BrdU(3 ng/mL)(Boster,中國)處理24 h;棄上清后預處理(4%多聚甲醛20 min,0.3%Triton X-100 15 min,3%BSA室溫1 h),后將心肌細胞在兔抗小鼠α-actinin抗體溶液(1∶100,Proteintech,美國)和抗小鼠BrdU單克隆抗體溶液(1∶100,Proteintech,美國)中4℃孵育過夜。然后細胞在山羊抗兔IgG-FITC溶液(1∶50,Proteintech,美國)和山羊抗小鼠IgG-TRITC溶液(1∶50,Proteintech,美國)在室溫下孵育1 h。最后用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,Beyotime,中國)對細胞核染色10 min,之后使用ImmunoFloure(Olumpus,日本)進行拍照,計數BrdU+α-actinin+細胞核比例和BrdU+α-actinin+單核心肌細胞比例。

1.3 Western blot檢測

利用Western blot技術檢測信號通路關鍵蛋白的磷酸化水平。具體流程如下:收集IL-6處理后的心肌細胞,或不同發育時間點的心臟組織,使用RIPA裂解液[50 mmol/L Tris(pH=7.4),150 mmol/L NaCl,1%Triton X-100,1%脫氧膽酸鈉,0.1%SDS和1 mmol/L苯甲基磺酰氟]制備可溶性標志蛋白的樣品,繼而使用BCA蛋白分析試劑盒(Pierce,美國)測定標志蛋白的濃度。制備SDS-PAGE凝膠,在每條泳道上添加30 μg蛋白質樣品電泳后轉移至PVDF膜上,最后加入抗體溶液進行孵育并使用Kodak BioMax ML膠片檢測免疫反應條帶。實驗應用的抗體分別為:兔抗鼠ERK1/2單抗(1∶1000,杭州華安生物技術有限公司,中國)和兔抗鼠p-ERK1/2單抗(1∶2000,Cell Signaling Technology,美國),USA兔抗鼠Akt單抗(1∶1000,杭州華安生物技術有限公司,中國)和兔抗鼠p-Akt多克隆抗體(1∶1000,杭州華安生物技術有限公司,中國),兔抗STAT3鼠多克隆抗體(1∶200,杭州華安生物技術有限公司,中國)和鼠抗鼠p-STAT3單抗(1∶200,Santa Cruz Biotechnology,美國)以及鼠抗鼠GAPDH單抗(1∶5000,湖北百奧斯生物科技有限公司,中國)。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 IL-6影響胚胎心肌細胞的增殖能力并具有發育依賴性變化

隨著心臟的發育成熟,小鼠心肌細胞逐漸從單核二倍體轉變成雙核四倍體[7-9]。而單核二倍體心肌細胞被認為是成年哺乳動物心肌再生能力的關鍵細胞來源[16-17]。因此,我們同時統計了IL-6對所有心肌細胞核以及對單核心肌細胞增殖能力的影響。我們發現小鼠胚胎心肌細胞增殖能力隨著發育成熟逐漸下降(圖1A、1B),主要體現為LDS的BrdU+α-actinin+細胞核比例和BrdU+α-actinin+單核心肌細胞比例均顯著低于EDS。其中,LDS的BrdU+α-actinin+單核心肌細胞比例為0(圖1B)。

A:免疫熒光技術檢測BrdU+α-actinin+心肌細胞;B:胚胎心肌細胞增殖能力發育依賴性下降,n=5;C:IL-6對EDS心肌細胞增殖能力的影響,n=6;D:IL-6對LDS心肌細胞增殖能力的影響,n=5;EDS:胚胎發育早期;LDS:胚胎發育晚期;與對照組比較,**P< 0.01;##P< 0.01

IL-6對胚胎心肌細胞增殖能力的影響具有發育依賴性。10 ng/mL IL-6不改變EDS的BrdU+α-actinin+細胞核比例和BrdU+α-actinin+單核心肌細胞比例(圖1C),但顯著增加LDS的BrdU+α-actinin+細胞核比例和BrdU+α-actinin+單核心肌細胞比例(圖1D)。

IL-6的作用具有濃度依賴性[18]。我們增加IL-6濃度至50 ng/mL,發現50 ng/mL IL-6減少EDS的BrdU+α-actinin+單核心肌細胞比例(圖1C);但對LDS BrdU+α-actinin+單核心肌細胞促增殖作用顯著強于10 ng/mL IL-6(圖1D)。50 ng/mL IL-6對EDS和LDS的BrdU+α-actinin+單核心肌細胞比例的反向作用,再次提示IL-6對胚胎心肌細胞增殖能力的影響具有細胞發育程度依賴性。

2.2 IL-6對胚胎心肌細胞3種信號通路關鍵蛋白磷酸化水平的影響

IL-6的生物學作用主要通過靶細胞膜表面的gp130蛋白激活JAK-STAT3、SHP2-RAS-ERK和PI3K-Akt信號轉導通路來實現[10-13],因此我們進一步利用Western blot技術檢測IL-6作用下gp130蛋白介導的3條不同信號轉導通路的關鍵蛋白質磷酸化水平。在EDS,10 ng/mL和50 ng/mL IL-6增加Akt、ERK和STAT3的蛋白總量,也增加3種蛋白的磷酸化水平(圖2A);但只抑制pAkt/Akt比值,對心肌細胞的pERK/ERK比值和pSTAT3/STAT3比值并無顯著影響(圖2B)。在LDS,10 ng/mL和50 ng/mL IL-6對Akt、ERK和STAT3的蛋白總量,以及3種蛋白的磷酸化水平的影響與其對EDS的作用相似(圖3A),但顯著增加pSTAT3/STAT3比值(圖3B)。這些結果提示IL-6并不同步影響JAK-STAT3、SHP2-RAS-ERK和PI3K-Akt信號轉導通路,并且該作用與IL-6對胚胎心肌細胞的增殖能力的影響相似,同樣具有發育依賴性。

A:IL-6對心肌細胞ERK、Akt和STAT3的磷酸化水平的影響;B:半定量分析IL-6處理后ERK、Akt和STAT3的磷酸化水平的變化;n=3;與對照組比較,*P< 0.05

A:IL-6對心肌細胞ERK、Akt和STAT3的磷酸化水平的影響;B:半定量分析IL-6處理后ERK、Akt和STAT3的磷酸化水平的變化;n=3;與對照組比較,*P< 0.05

2.3 不同發育階段gp130蛋白介導的信號轉導通路基礎狀態不同

我們的前期研究發現二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)對胚胎心肌細胞增殖能力的影響同樣具有發育依賴性,并且和信號通路基礎狀態有關,即由于EDS心肌的基礎STAT3磷酸化水平高于LDS,DMSO促進STAT3磷酸化的程度在LDS比EDS更顯著,所以DMSO在增加LDS心肌細胞增殖能力的作用也顯著高于EDS[19]。因此我們繼續采用Western blot檢測上述幾個關鍵蛋白質在發育過程中的基礎水平,發現隨著胚胎發育成熟,ERK、Akt和STAT3的總蛋白和3種蛋白質磷酸化水平均呈發育依賴性下降(圖4A)。通過半定量分析,pERK/ERK和pSTAT3/STAT3的比值也隨著發育成熟逐漸下降,尤其是pSTAT3/STAT3比值在胚胎期已經出現明顯下降;而pAkt/Akt比值隨發育逐漸增加(圖4B)。

EDS:胚胎發育早期,LDS:胚胎發育晚期,P7:出生后7 d;P14:出生后14 d;Adult:成年小鼠;n=3

3 討論

我們的既往研究發現心臟成纖維細胞分泌IL-6的能力呈發育依賴性上升[15],在小鼠胚胎干細胞離體心肌分化過程中IL-6作用具有發育依賴性變化[18]。而自然情況下,隨著個體發育成熟心肌細胞的分裂增殖能力逐漸下降[7]。本研究發現EDS心肌細胞的增殖能力顯著高于LDS心肌細胞。尤為重要的是,我們發現IL-6對心肌細胞增殖的影響具有發育依賴性變化:10 ng/mL IL-6對EDS心肌細胞增殖能力并無明顯影響,而50 ng/mL IL-6減少BrdU+單核心肌細胞數目;而10 ng/mL和50 ng/mL IL-6均增加LDS BrdU+α-actinin+細胞核比例和BrdU+α-actinin+單核心肌細胞比例。特別值得注意的是,50 ng/mL IL-6抑制EDS單核心肌細胞的增殖卻促進LDS單核心肌細胞的增殖。單核二倍體心肌細胞被認為是不同物種,或者是同一物種不同背景動物之間心肌細胞再生能力差異的關鍵細胞基礎[16-17]。這提示IL-6對單核心肌細胞增殖的作用是IL-6的重要生物學效應之一,會在生理狀態和疾病發展過程中產生一定的積極作用。

上述IL-6作用的變化是因為IL-6對gp130蛋白介導的信號通路的影響不同,可能與JAK-STAT3通路有關。多項研究證實,心肌細胞增殖能力與下游ERK、Akt和STAT3的磷酸化水平有關[20-22]。我們發現10 ng/mL和50 ng/mL IL-6對EDS心肌細胞的ERK和STAT3磷酸化均無顯著影響,但顯著減少Akt的磷酸化水平。在LDS,10 ng/mL和50 ng/mL IL-6均抑制Akt的磷酸化,促進STAT3的磷酸化水平。這說明這三個信號通路不同程度地介導了IL-6對胚胎心肌細胞增殖能力的調節:在EDS,IL-6不能激活gp130蛋白介導的信號通路,所以未展現出促增殖作用,甚至出現抑制作用;在LDS,IL-6促進STAT3的磷酸化,進而促進心肌細胞增殖。這與已報道的IL-6上調STAT3磷酸化而促進新生鼠心肌細胞的增殖能力一致[10]。然而我們的數據并不能很好地解釋IL-6對Akt磷酸化的抑制作用,以及這種抑制作用和IL-6對細胞增殖能力影響的相關性。

IL-6對EDS和LDS三個信號轉導通路的影響不同,特別是STAT3磷酸化程度的不同,可能與不同發育階段關鍵蛋白質的基礎狀態密切相關[19]:通過Western blot發現EDS、LDS、P7、P14和成年小鼠ERK、Akt、STAT3的總蛋白含量和磷酸化水平均隨發育逐漸成熟而下降。此外,EDS和LDS心肌細胞表面的IL-6受體表達量、gp130蛋白表達量以及其他gp130蛋白介導的信號通路如Hippo、Notch和mTOR等信號轉導系統[14]差異也可能導致了IL-6對EDS和LDS心肌細胞增殖能力影響的差異性。這些因素可能是50 ng/mL IL-6抑制EDS單核心肌細胞增殖和(或)促進LDS單核心肌細胞增殖的機制。

IL-6作為心臟細胞微環境中的一種重要細胞因子,已經被證實在慢性心力衰竭和心肌梗死等心肌細胞損傷時分泌大量增加,有利于促進心肌細胞的修復能力[23-25]。我們發現IL-6以發育依賴的方式影響心肌細胞增殖能力,這可能與IL-6在不同階段的不同靶向通路有關。這些發現為心臟發育提供了新知識,也為細胞替代療法的研究提供了新線索。