石蒜堿對宮頸癌HeLa細胞PI3K/Akt信號通路的調控作用研究①

徐振宇,盧林俠,吉夫次里,王佩珊,趙 勇,張小萌,李卓爾

(佳木斯大學,黑龍江 佳木斯 154007)

宮頸癌是最常診斷的癌癥之一,同時也是女性癌癥死亡的常見原因之一[1]。且近年來發病率呈不斷上升趨勢,并逐漸向年輕化發展,嚴重威脅女性身體健康[2]。同時,由于人口老齡化的加速以及性觀念的改變,宮頸癌的防控形勢愈加嚴峻。石蒜堿屬于異喹啉類生物堿,作為傳統的藥用植物,具有抗炎,抗病毒等多種生物活性,且對多種腫瘤具有較好的抑制作用[3]。體外實驗表明,石蒜堿對非小細胞肺癌[4],人結直腸癌細胞[5],前列腺癌[6]等都有明顯的抑制作用。然而,石蒜堿對宮頸癌的作用未見報道。PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活可參與多種腫瘤的病理發生過程,腫瘤細胞在PI3K活化后,通過激活下游的Akt,對凋亡的誘導產生耐受,異常增加細胞的生長代謝。在卵巢癌和乳腺癌病理過程中,可引起腫瘤細胞的遷移、加速細胞周期、減少細胞凋亡。在宮頸癌細胞中PI3K/AKT可影響其增殖凋亡,因此本實驗通過體外實驗加入石蒜堿并對各項指標測定,探討石蒜堿抗宮頸癌HeLa細胞影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 Hela細胞

人宮頸癌Hela細胞由佳木斯大學生命科學實驗中心提供。

1.2 藥物及試劑

石蒜堿(成都曼思特生物科技有限公司,HPLC≥98%),采用含有0.1% DMSO的DMEM配置成不同濃度;培養基、血清購自Gibco公司; CCK8、BCA試劑盒購自碧云天生物技術有限公司; PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、Cleaved Caspase-3、β-actin抗體購自美國Santa公司;Annexin V-FITC/7AAD凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.3 CCK-8法檢測細胞活力

將Hela接種在96孔板中,待細胞融合至80%時,換無血清培養液饑餓處理24h。按空白對照組、細胞對照組和溶劑對照組的分組并加入相應藥物培養24h,向每孔中加入CCK8試劑10μL,培養2h,酶標儀檢測450nm波長處各孔的光密度(OD)值,以其表示細胞增殖活性。每組設5個復孔,實驗重復3次。細胞增殖抑制率 = (細胞對照組OD值-給藥組OD值)/(細胞對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。

1.4 劃痕實驗的測定

將Hela接種到6孔板中,待細胞貼壁生長至密度70%～80%時更換為無血清培養液餓處理24h。使用200μL的無菌槍頭直在細胞板上均勻劃線造成幾條劃痕。PBS洗滌3次去除劃的細胞加含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養液制備不同濃度的石蒜堿溶液,將石蒜堿溶液加入劃痕區域的細胞中,每個劃痕組設置不同濃度的石蒜堿。加入相應藥物每隔12h顯微鏡下觀察細胞劃痕開口率并采集圖像。每組設3復孔,三次獨立實驗。

1.5 流式細胞術檢測人宮頸癌Hela細胞的凋亡

從待檢測的細胞中抽取樣本,在顯微鏡下觀測其生長發育情況,確保無環境污染,細胞覆蓋率到達90%之上。然后棄掉舊液,進行常規清洗、消解、離心,吸出上清液,最后加入PBS進行細胞沉積2遍。采取適當的動作,以免損害細胞,影響實驗結果。然后將500μLBinding Buffer加入細胞懸液中,輕柔攪拌,然后加入5μL Annexin V和5μL 7-AAD染液,在室溫下避光染色15min,以獲得最佳的染色效果。完成后,1h內送流式細胞儀上機檢測細胞調亡。記錄檢測數據,計算凋亡細胞的比例,并加以數據分析,以便描繪圖形。

1.6 Western blot 法

使用BCA法進行蛋白定量,5×上樣緩沖液與樣品蛋白以1:4的比例混勻,100℃煮沸15min。配制電泳膠凝膠后,蛋白樣品上樣、電泳,轉膜,5%脫脂奶粉(或5%BSA),37℃水浴搖床封閉1h。TBST洗膜5次,一抗4℃過夜。使用TBST洗膜5次,每次6min。二抗37℃孵育1h,TBST洗膜5次,每次6min。進行化學發光顯影。

1.7 統計學方法

采用SPSS23.0統計服務軟件對數據進行統計及處理,多樣本均數對比采用單因素方差分析(ANVOA)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 石蒜堿對Hela增殖的抑制作用

不同濃度石蒜堿作用Hela細胞可降低人宮頸癌細胞增殖率。細胞增殖率隨著藥物濃度增加和作用時間延長逐漸降低。與對照組比較石蒜堿作用Hela細胞24h、48h、72h的細胞活力從1.25μM開始的差異有統計學意義(P<0.05),見圖1。

圖1 石蒜堿對Hela細胞增殖的影響

2.2 石蒜堿對Hela細胞遷移能力影響

與對照組組比較,隨著石蒜堿濃度的升高細胞遷移數顯著降低(P<0.01)。與此同時,隨著石蒜堿濃度作用時間延長細胞遷移數也顯著降低,見圖2。

圖2 石蒜堿對Hela細胞遷移能力的影響

2.3 石蒜堿誘導Hela細胞的凋亡

不同濃度的石蒜堿(0、1.25、2.5μM)作用于人宮頸癌Hela細胞24h后,經流式細胞術檢測結果細胞調亡率隨著石蒜堿給藥濃度的增加而增加,且呈劑量依賴性關系,各給藥組細胞調亡率與陰性對照組比較有顯著性差異,有統計學意義(P<0.01),見圖3。

圖3 石蒜堿對Hela細胞凋亡的影響

2.4 石蒜堿抗宮頸癌Hela細胞對PI3K/Akt通路的影響

不同濃度的石蒜堿(0、1.25、2.5μM)作用于人宮頸癌Hela細胞24h后,經Western Blot檢測,與對照組相比,隨著石蒜堿濃度的升高,PI3K、AKT蛋白不變,P-PI3K、P-AKT蛋白水平逐漸降低,凋亡相關蛋白Cleaved caspase-3蛋白逐漸升高,差異有統計學意義,見圖4。

圖4 石蒜堿對Hela細胞PI3K/AKT信號通路及凋亡相關蛋白的影響

3 討論

宮頸癌在發展中國家其發病率高居第一位[7]。每年全世界約有46.5萬人罹患宮頸癌疾病,我國新增病例占其中30%,約13.15萬,死亡數約為5萬。在我國由于經濟等因素影響,80%的患者確診時已是浸潤癌,而且出現了患病逐漸年輕化的趨勢[8-9]。宮頸癌中晚期主要以泰素及鉑類的化療作為主要的治療手段,但化療不敏感是導致治療失敗的重要因素,使得宮頸癌的治療處于瓶頸階段。尋找新的治療方法和有效的治療藥物成為宮頸癌研究關鍵的問題之一,從中藥中尋找有效抗癌成分為化療藥物的研究熱點。

石蒜堿(lycorine)具有獨特的結構和豐富的藥理活性,是從我國廣泛分布的草本植物石蒜鱗莖中分離出的一種化學單體。研究發現石蒜堿對多種腫瘤細胞株均顯示良好的抗腫瘤活性[10],且作用機制與其抗增殖、細胞凋亡誘導作用有關。然而,石蒜堿對宮頸癌細胞的影響卻留有空白,因此本實驗以此為出發點,開展石蒜堿對宮頸癌細胞增殖凋亡的研究。本實驗分別在24h、48h、72h檢測不同濃度的石蒜堿對宮頸癌細胞的活力,發現宮頸癌發現石蒜堿的作用時間和作用濃度與宮頸癌細胞的存活率相關。石蒜堿作用時間延長或作用濃度增加可使宮頸癌細胞增殖率逐漸降低。與此同時,通過劃痕實驗,我們證實了石蒜堿抑制宮頸癌細胞的遷移?；谝陨鲜鈮A對宮頸癌的影響,我們進一步采用流式細胞術檢測石蒜堿對宮頸癌細胞凋亡的影響,發現隨著石蒜堿濃度的增加,宮頸癌細胞的凋亡逐漸增強。

由于石蒜堿對宮頸癌細胞的增殖、凋亡、遷移都產生了影響,他們共同的上游通路成為我們的研究目標。在非小細胞肺癌細胞(NSCLC)中,PI3K/AKT信號的激活抑制NSCLC的增殖、遷移和侵襲[11];在皮膚鱗狀細胞癌中,miR-20a通過靶向CCND3的水平抑制PI3K/AKT信號通路的激活,抑制細胞增殖、侵襲和遷移,促進細胞凋亡[12]。因此,PI3K/AKT可對癌細胞的增殖、凋亡、遷移都可產生影響。在宮頸癌細胞中,大量研究表明PI3K/AKT信號通路可影響宮頸癌細胞的生長:黏蛋白家族基因CDH3通過激活PI3K/AKT促進宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲[13];右美托咪定通過PI3K/AKT對宮頸癌細胞凋亡產生影響[14]。在肝癌細胞中,石蒜堿也可通過影響AKT的磷酸化從而對凋亡產生影響[15]。綜合分析,一方面,PI3K/AKT作為與癌癥發展相關的重要通路,在宮頸癌細胞中也被證實可發揮作用;另一方面,石蒜堿也可通過AKT的磷酸化發揮抗癌作用,因此我們試圖研究石蒜堿能否通過PI3K/AKT信號通路影響宮頸癌的發生發展。我們采用不同濃度的石蒜堿作用于宮頸癌細胞24h后,Western Blot檢測證實隨著石蒜堿濃度的增加,P-PI3K、P-AKT蛋白水平逐漸降低,凋亡相關蛋白Cleaved caspase-3蛋白逐漸升高,表明石蒜堿可能通過抑制PI3K/AKT信號通路抑制宮頸癌細胞的凋亡。

綜上所述,石蒜堿可降低宮頸癌Hela細胞活力,抑制細胞增殖、遷移并增加細胞凋亡。石蒜堿抗宮頸癌的功效可能與PI3K/AKT信號通路的下調有關,但其中的下游調控機制還需進一步實驗研究。