羊三聯滅活疫苗對妊娠母羊安全性及羔羊被動免疫效果評價

白帆，王娜，宋越，張帆，張月梅，曹曉東，錢林娜，戴伶俐*

（1.內蒙古自治區農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特 010031； 2.內蒙古醫科大學藥學院新藥安全評價研究中心，內蒙古 呼和浩特 010020）

隨著肉羊產業的快速發展，集約化、規?；潭炔粩嗵岣?，羊混合病原感染引起的傳染性胸膜肺炎（俗稱爛肺?。┏蔀轲B羊生產的重大疾患問題，造成的損失巨大。綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae, M.ovi)是引起綿羊、山羊、大角羊和野生小反芻動物慢性肺炎的主要病原，引起患病羊只進行性消瘦、痙攣性咳及喘等癥狀，病程可持續數月至數年[1-2]。本團隊從內蒙古的多個地區分離到該病原，該病在規?；B殖場的發病率為14.3%～75%（引進品種羔羊）。羊多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida, Pm）A/D 型常與支原體混合感染或冷、熱應激后繼發性感染，引起羊常見的細菌性呼吸道傳染病，導致羊只出現嚴重的纖維素性肺炎和其他肺臟病變，危害性不斷增大[3]。近年來，隨著養羊業生產方式的轉變，一些地區的綿羊、羔羊和育肥青年羊有地方性群發的報道，發病率為31%～87.5%，病死率為18.6%～41%，成年羊也常有散發[4]。本團隊在2016—2022 年從內蒙古、遼寧、山東、陜西及寧夏等地采集777 份鼻拭子樣本，檢測M.ovi、PmA 及PmD 的感染情況，其中M.ovi 陽性245 份，陽性率為31.53%；PmA陽性223 份，陽性率為28.70%，PmD 陽性210 份，陽性率為27.03%；巴氏桿菌和M.ovi 混合感染陽性樣本138 份，陽性率為17.76%。

雖然，國內現有針對山羊傳染性胸膜肺炎的支原體雙價滅活疫苗，但是對于山羊、綿羊預防效果并不理想（據不完全統計，這些疫苗對羊傳染性肺炎的保護率在75%以下）[5]。試驗研究和診治實踐表明，單一種類疫苗的針對性差，產生的免疫抗體對混合感染病原毒株抗原的中和覆蓋度低是問題產生的主要原因和關鍵根源[6-7]。該項目開展了M.ovi、Pm（A/D 型）聯合滅活疫苗的研究，通過對地方羊場優勢流行菌株的分離和候苗株的篩選，實驗室嘗試研制出針對綿羊爛肺病的復方油佐劑自家滅活疫苗，攻毒保護率可達86.2%。為考查該疫苗對妊娠期母羊免疫接種的安全性，以及進一步確定新生羔羊通過初乳獲得母源抗體的水平，以高繁湖羊懷孕母羊及其新生羔羊為研究對象。

1 試驗材料

1.1 試驗動物

已懷孕120 d 的純種湖羊購自巴彥淖爾市五原縣金草原生態科技集團有限公司，6 月內未免疫山羊支原體肺炎雙價疫苗（四川海大生物出品），ELISA 檢測M.ovi、Pm 血清抗體呈陰性，PCR 檢測鼻拭子無M.ovi、Pm（A/D 型）等感染。

1.2 試驗疫苗及試劑

綿羊肺炎支原體-多殺性巴氏桿菌A/D 型三聯滅活疫苗由本實驗室試制；支原體基礎培養基、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養基購自廣東環凱微生物科技有限公司（HKM，廣東）；脫脂乳、特級馬血清購自北京索萊寶科技有限公司（Solarbio，北京）；BCA 蛋白定量試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司（TIANGEN，北京）；ELISA 板、HRP 標記兔抗綿羊IgG（H+L）購自生工生物工程（上海）股份有限公司（Sangon Biotech，上海）；其他未注明試劑均為國產分析純試劑。

1.3 儀器與設備

酶標儀購自Bio-Rad 公司。

1.4 數據統計

使用GraphPad Prism 5 統計學軟件對數據進行統計及差異性分析。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。

2 試驗方法

2.1 妊娠后期母羊疫苗接種安全性評價

如表1 所示，試驗將15 只懷孕母羊隨機分為3組，分別為連續免疫單一劑量試驗組、超劑量免疫試驗組及PBS 對照組，每組5 只。其中，連續免疫單一劑量試驗組羊只疫苗免疫劑量為5 mL/只，共免疫4 次，每次免疫時間間隔7 d； 超劑量免疫試驗組羊只疫苗免疫劑量為10 mL/只，共免疫1 次；PBS 對照組羊只免疫PBS 作為對照，免疫劑量為5 mL/只。采用頸部皮下注射方式，免疫后及產羔前后統計流產率、弱羔率、早產2 周齡羔羊存活率及致畸率等情況。

表1 疫苗安全性評價分組方式

2.2 新生羔羊母源抗體獲得水平及妊娠母羊抗體評價

2.2.1 妊娠羊免疫設計。試驗將20 只懷孕母羊隨機分為2 組，分別為免疫試驗組及PBS 對照組，每組10只。免疫劑量為5 mL（表2），采取頸部皮下注射。母羊分別在免疫前、免疫后14 d 及28 d 采血。羔羊出生后24 h 內保證及時攝入足量初乳。同時在羔羊出生后第1、3、6、9、12 及15 天分別采血，分離血清后于-20 ℃保存備用。

表2 妊娠母羊免疫分組方式

2.2.2 抗體評價。M.ovi 及Pm 分別利用加有10%馬血清的支原體培養基及TSB 培養基培養至對數生長期，分別取適量培養液12 000 r/min 離心30 min 后棄上清，用等量PBS 溶液重懸沉淀，以上步驟重復3次后將菌體沉淀重懸，0 ℃冰浴條件下利用超聲破碎儀破碎菌體，釋放菌體蛋白。使用BCA 蛋白定量試劑盒對菌體總蛋白進行定量后，利用碳酸鹽包被液稀釋菌體蛋白至0.5 μg/孔后包被ELISA 板，取200 μL 濃度為50 g/L 的脫脂乳37 ℃封閉2 h 后用PBST 洗3次。進行M.ovi 或Pm 抗體檢測的羊血清分別以體積比為1∶100 和1∶200 稀釋，并按100 μL/孔分別加入上述ELISA 板中，37 ℃孵育90 min，PBST 洗3 次。每孔加入100 μL 按體積比1∶10 000 稀釋的兔抗綿羊HRP-IgG，37 ℃孵育1 h，PBST 洗3 次。利用TMB 底物溶液顯色25 min 后，取2 mol/L 硫酸100 μL/孔終止顯色，并分別測量其OD450。

2.3 新生羔羊獲得母源抗體被動免疫效果評價

新生羔羊在出生60 d 后，每組隨機抽選3 只進行剖檢，觀察呼吸系統病變情況，并依據肺臟病變評分標準進行評測。羊只肺臟分為7 葉，每葉肺臟根據病變面積不同進行相應打分，0%～25%面積病變評為1 分；25%～50%面積病變評為2 分；50%～75%面積病變評為3 分；75%～100%面積病變評為4 分； 滿分為28 分。

3 試驗結果

3.1 妊娠后期母羊疫苗接種安全性評價

為進行妊娠后期母羊疫苗接種安全性評價，本試驗對3 組懷孕母羊在完成免疫后分別統計流產率、弱羔率、早產2 周齡羔羊存活率及致畸率情況。試驗觀察至懷孕母羊產羔后第60 天。如表3 所示，3 組試驗妊娠羊只均未發生流產及早產2 周情況，分娩羔羊均健康成活，沒有弱羔及致畸現象。

表3 疫苗接種安全性評價結果 單位：%

3.2 妊娠母羊免疫效果評價

為進行新生羔羊母源抗體獲得水平的評價，本研究首先評價了懷孕母羊產前抗體水平。如圖1 結果所示，在對M.ovi 及Pm 抗體水平評價中，免疫前2 組懷孕母羊相應抗體水平均較低，組間沒有統計學差異；在免疫后14 d，免疫試驗組母羊M.ovi 及Pm 抗體水平出現較大幅度上升，與PBS 對照組相比差異極顯著；在免疫后28 d，免疫試驗組母羊M.ovi 及Pm抗體水平依然維持在較高水平，與PBS 對照組相比依然存在極顯著差異。

圖1 懷孕母羊M.ovi 及Pm 抗體水平

3.3 新生羔羊母源抗體獲得水平評價

為進行新生羔羊母源抗體獲得水平的評價，本研究對妊娠120 d 母羊進行滅活疫苗免疫，并在羔羊出生第1、3、6、9、12 和15 天進行采血，以評價母源抗體獲得水平?？贵w檢測結果如圖2 所示，在對M.ovi 抗體水平評價中，羔羊出生第1 天抗體水平組間無統計學差異；在出生后3 d 時，免疫試驗組母羊所產羔羊抗體水平達到最大值，與PBS 對照組所產羔羊抗體相比差異極顯著，PBS 對照組所產羔羊抗體與第1 天相比出現下降；在出生后6、9、12 和15 d 時，免疫試驗組母羊所產羔羊抗體水平與PBS 對照組所產羔羊抗體均出現下降，但組間差異比較顯著。

圖2 新生羔羊母源M.ovi 及Pm 抗體獲得水平

在對Pm 抗體水平評價中，羔羊出生第1 天抗體水平組間無統計學差異； 在出生后3、6、9、12 和15 d時，PBS 對照組所產羔羊抗體水平與第1 天相比均出現不同程度的下降，但免疫試驗組母羊所生羔羊抗體水平變化并不明顯，因此兩組間相比差異極顯著。

3.4 新生羔羊母源抗體被動免疫效果評價

為確定獲得母源抗體被動保護羔羊的保護效果，新生羔羊在出生60 d 后對其進行剖檢，觀察呼吸系統病變情況，并依據肺臟病變評分標準進行評測。結果如圖3 所示，PBS 對照組所產羔羊肺臟右側前葉及左右側中葉出現肉樣實變，病變現象明顯。免疫試驗組母羊所產羔羊肺臟粉紅有彈性，未見明顯病變。對2 組肺臟分別評分后，組間差異極顯著，評分結果見圖4。

圖4 新生羔羊剖檢肺臟病變評分結果

4 討論

目前由于現有支原體雙價滅活疫苗覆蓋病原譜窄，預防效果并不理想。本研究通過對內蒙古地區各區域羊場優勢流行菌株進行分離并篩選候苗株，嘗試研制出針對綿羊爛肺病的M.ovi、Pm（A/D 型）聯合滅活疫苗。為考查該疫苗對妊娠期母羊免疫接種的安全性，對孕后期母羊進行了連續免疫單一劑量免疫試驗及單次超劑量免疫試驗。試驗結果發現，懷孕羊未出現早產、流產現象及征兆，所產羔羊未出現致畸現象，證明本疫苗對懷孕母羊安全可靠無副作用。同時為進一步確定新生羔羊通過初乳獲得免疫母羊母源抗體的水平，以高繁湖羊懷孕母羊及其新生羔羊為研究對象，采用ELISA 檢測對懷孕母羊及新生羔羊血清抗體水平進行評價。結果顯示，懷孕母羊在接受1 次三聯滅活疫苗免疫后即可產生抗M.ovi 及Pm 抗體，且與PBS 對照組相比差異極顯著。

新生羔羊在接受免疫母羊充足初乳飼喂后，免疫試驗組母羊所產羔羊可獲得相應被動性保護抗體，且與PBS 對照組母羊所產羔羊相比差異極顯著。這說明母源抗體可通過初乳有效傳遞給新生羔羊。同時為進一步印證試驗效果，本團隊在新生羔羊出生60 d 后進行迫殺剖檢，剖檢結果與ELISA 結果相符，接受母源抗體被動保護的羔羊得到有效保護。

5 結論

本團隊新研制的綿羊肺炎支原體-多殺性巴氏桿菌A/D 型三聯滅活疫苗應用于孕后期母羊時安全可靠，未出現流產、弱羔、早產2 周齡羔羊及致畸等情況。

本團隊新研制的綿羊肺炎支原體-多殺性巴氏桿菌A/D 型三聯滅活疫苗免疫孕畜后，初生羔羊可通過被動免疫，使相應抗體水平上升，獲得可靠的免疫保護。