犢牛輪狀病毒RT-LAMP 檢測方法的建立與應用

韓子陽，趙洋，唐欣如，張榕蘭，馮靜萱，王嘉羽，特木爾巴根，郭宇，武婭楠，張志丹，周偉光*

（1.內蒙古農業大學 獸醫學院農業農村部動物疾病臨床診療技術重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018； 2.中美冠科生物技術有限公司，北京 100000； 3.內蒙古自治區動物疫病預防控制中心，內蒙古 呼和浩特 010020）

輪狀病毒（rotavirus，RV）是造成人和動物腹瀉最主要的病原體。牛輪狀病毒（bovine rotavirus，BRV）是全球范圍內造成犢牛腹瀉的最主要病原體之一[1]。在大量的犢牛腹瀉病例中，BRV 引起的犢牛腹瀉發生率最高，約占犢牛腹瀉病例的46%，有時高達100%，而死亡率相對較低，通常為10%左右，病畜多死于繼發感染[2]。在我國河北、山西、云南、內蒙古、西藏和貴州等地牛群中，BRV 的感染也普遍存在[3]。因此，建立BRV 的快速檢測方法成為犢牛腹瀉防控的關鍵環節[4]。

BRV 屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，為無囊膜雙鏈RNA 病毒[5]，可通過糞口途徑傳播，多在早春、晚秋、冬季、氣候驟變和衛生條件差的情況下發生[6]。該病毒可導致犢牛出現精神萎靡、腹瀉和嘔吐等臨床癥狀[7]。犢牛出生2 周內，BRV 的分離率高達94%[8]，而隨著感染牛月齡的增加，其常表現為隱性感染，無明顯臨床癥狀，診斷困難，導致養殖過程中易忽視BRV在牛群中的潛在傳播，加快疾病蔓延速度。因此，建立有效快速的檢測方法，對預防和控制BRV 感染具有重要意義[9]。RT-PCR 是目前檢測該病毒最常用的方法，但在應用過程中存在一些不足，如操作復雜費時、局限在實驗室操作等，不能完全滿足基層快速、準確檢測的需求[10]。

環介導等溫擴增技術 （loop-mediated isothermal amplification，LAMP） 是一種新型的核酸擴增技術[11]，是近年發展起來的一項疾病快速臨床診斷方法。LAMP 反應針對靶基因6～8 個區域設計4～6 條引物，僅需一種具鏈置換活性的DNA 聚合酶 （如Bst、Gsp等）便可在60～66 ℃的恒定溫度下實現幾十分鐘內大于109～1010倍的靶基因擴增[12]。擴增產物可以通過濁度計、電泳和向試管反應中添加熒光染料進行檢測[13]。這種變化可以用肉眼觀察，非常適合現場檢測[14]，同時LAMP 方法還有操作條件簡單、操作方便的優點。建立快速檢測BRV 的RT-LAMP 方法，有助于牛場犢牛腹瀉的診斷和防控。

1 材料與方法

1.1 病毒、細菌及樣品

牛傳染性鼻氣管炎病毒 （infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛副流感病毒3 型（bovine parainfluenza virus，BPIV3）、大腸桿菌、沙門菌、BRV 和牛冠狀病毒 （bovine coronavirus virus，BCV）由內蒙古農業大學獸醫學院獸醫傳染病學教研室提供；牛腹瀉糞樣均采自呼和浩特市周邊的規?；B牛場，于實驗室-80 ℃保存。

1.2 主要試劑

病毒DNA/RNA 基因組提取試劑盒、質粒提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒和克隆菌DH5α、dNTPs（10 mmol/L） 購自天根生化科技公司；HiScript?II One Step RT-PCR Kit （Dye Plus） 試劑盒購于Vazyme 公司；500 bp 和1 000 bp DNA marker、pMD19-T 購于TaKaRa 公司；Bst 3.0 DNA 聚合酶（8 000 U/mL）、MgSO4（100 mmol/L）、10×ThermoPol反應緩沖液為New England Biolabs 公司產品；SYBR Green I 購自百奧萊博。

1.3 主要儀器

高速冷凍離心機和梯度PCR 儀，德國Eppendorf公司； 臺式離心機和生物安全柜，美國Thermo Scientific 公司；凝膠成像儀，英國SYNGENE 公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 引物設計。參考GenBank 中的BRV NSP 序列，利用軟件Lasergene 中的MegAlign 程序對BRV 的多個序列進行比對，根據對比結果利用Primer DesignV5 軟件設計合成BRV 的RT-LAMP 反應所需的引物，結果如表1 所示（外引物為F3 和B3，內引物為FIP 和BIP）。

表1 RT-LAMP 擴增BRV 的引物序列

1.4.2 病毒和細菌核酸的提取。核酸提取參照DNA/RNA 基因組提取試劑盒的說明書進行。

1.4.3 BRV RT-LAMP 標準品的制備。用表1 中BRV RT-LAMP 外引物，通過對目的基因進行普通RT-PCR 擴增，反應體系模板為1.4.2 步驟提取的BRV RNA。反應體系：2×One Step Mix 12.5 μL、One Step Enzyme Mix 1.25 μL、F3 1.0 μL、B3 1.0 μL、模板2.0 μL、RNase-free ddH2O 7.25 μL；反應程序：反轉錄50 ℃30 min； 預變性94 ℃3 min； 變性94 ℃30 s；退火58 ℃30 s；延伸72 ℃30 s；終延伸72 ℃7 min，共35 個循環。參考AxyPreP DNA 凝膠回收試劑盒說明書，獲得RT-PCR 純化產物，將其與pMDTM19-T Vector 進行連接，取10 μL 的連接產物加入100 μL 的DH5α 感受態細胞中進行轉化，提取BRV 重組質粒并進行PCR 和測序鑒定計算重組質粒pMD19T-BRV 質?？截悢?。計算公式：質?？截悢担╟opies／μL）=6.02×（重組質粒濃度ng／μL×10-9）×1023/（660×重組質粒堿基數）。稀釋陽性標準品時使用稀釋液分別對重組質粒pMD19T-BRV 進行109～100（copies／μL）10 倍梯度稀釋制成標準品，于-20 ℃保存。

1.4.4 RT-LAMP 方法的優化。RT-LAMP 方法的反應體系見表2。本試驗針對反應體系Mg2+（100 mmol/L）、dNTPs（10 mmol/L）、內引物的用量以及反應條件時間和溫度進行優化。其中，不同dNTP 的量分別為0.5、0.8、1.2、1.5 和1.8 μL；不同Mg2+用量分別為0.2、0.5、0.8、1.2 和1.5 μL；不同內引物用量分別為0.5、1、1.5、2 和2.5 μL（內引物濃度為10 μmol/L、外引物用量均為10 μmol/L，0.5 μL）； 通過試驗的結果選擇最佳RT-LAMP 反應體系。反應溫度分別采用58.0、60.0、62.0、63.0、64.0、65.0 和66.0 ℃。反應時間分別采用30、45、60、90 和120 min；對RT-LAMP 擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳分析。每次檢測時，設置陰性對照（健康牛的基因組DNA）；在陰性對照和陽性對照均成立時，整個試驗有效，可判定結果。

表2 RT-LAMP 反應體系中各成分及其體積

1.4.5 RT-LAMP 檢測BRV 的敏感性。將BRV 重組質粒進行10 倍梯度稀釋，用于RT-LAMP 方法對BRV 的敏感性進行檢測，并與普通的RT-PCR 對BRV 的敏感性進行比較。

1.4.6 RT-LAMP 檢測BRV 的特異性。應用試劑盒提取IBRV、BPIV3、大腸桿菌、沙門菌和BRV 的核酸，以106copies/μL 的pMD19T-BRV 標準品作為陽性對照，通過SYBR Green I 對RT-LAMP 反應體系進行顯色反應和凝膠電泳，對BRV 檢測方法的特異性進行試驗。

1.4.7 RT-LAMP 檢測BRV 的重復性。選取終濃度為1×105copies/μL BRV 的重組質粒，運用建立并優化后的BRV RT-LAMP 檢測方法，對模板進行3 組重復試驗，驗證該方法是否穩定。

1.4.8 RT-LAMP 用BRV 的臨床檢測。利用DNA/RNA 基因組提取試劑盒從腹瀉糞樣中提取RNA，再運用本試驗建立的優化后的RT-LAMP 檢測方法和普通RT-PCR 檢測方法分別對38 份犢牛腹瀉糞樣進行檢測，并比較這2 種方法的BRV 檢出率，驗證優化后的RT-LAMP 檢測方法是否高效且信任度高。

2 結果與分析

2.1 BRV RT-LAMP 反應體系優化結果

如圖1 所示，通過對dNTP（圖1A）的用量、Mg2+（圖1B）、內引物用量（圖1C）、反應時間（圖1E）和反應溫度（圖1D）5 個方面反應體系進行了優化，結果顯示，dNTP （10 mmol/L） 最佳用量為2 μL，Mg2+（100 mmol/L）最佳用量為0.8 μL，內引物最佳用量為2 μL，最佳反應溫度為62 ℃，最佳反應時間為45 min。

圖1 BRV RT-LAMP 反應體系優化結果

2.2 RT-LAMP 檢測BRV 敏感性

利用本試驗建立的優化后的RT-LAMP 反應體系，對BRV 進行擴增反應，將按倍數稀釋的BRV 重組質粒作為模板，同時將普通的RT-PCR 方法用于敏感度的比較。將2 種方法的擴增產物進行凝膠電泳檢測，結果如圖2 和圖3 所示。普通RT-PCR 方法的敏感度為1×103copies/μL，而本試驗建立的RT-LAMP方法的敏感度為1×102copies/μL。

圖2 RT-PCR 檢測BRV 敏感度結果

圖3 RT-LAMP 檢測BRV 敏感度結果

2.3 RT-LAMP 檢測BRV 特異性

利用本試驗建立的優化后的RT-LAMP 反應體系，對BRV 檢測方法的特異性進行驗證，結果如圖4所示，只有BRV 的重組質粒有特異性擴增，反觀其他細菌、病毒核酸和陰性對照均無特異性擴增，說明本試驗建立的這種RT-LAMP 反應體系具有較好的特異性。

圖4 RT-LAMP 檢測BRV 特異性結果

2.4 RT-LAMP 顯色法檢測BRV 特異性

利用本試驗建立的優化后的RT-LAMP 反應體系，對BRV 檢測方法的特異性進行試驗，并運用1 000×SYBR GREENⅠ對反應體系進行顯色反應。結果如圖5 所示，只有BRV 重組質粒顯示特異的黃綠色，而其他細菌、病毒核酸和陰性對照為橙色，進一步證實了本試驗建立的RT-LAMP 方法具有較好的特異性。

圖5 RT-LAMP 顯色法檢測BRV 特異性結果

2.5 RT-LAMP 檢測BRV 重復性

選取終濃度為1×105copies/μL 的BRV 的重組質粒，每種模板重復3 次，進行RT-LAMP 檢測反應。如圖6 所示，3 組模板對比無較大差異，說明本方法重復性較高，檢測結果穩定性較好。

圖6 RT-LAMP 檢測3 組BRV 重復性結果

2.6 RT-LAMP 檢測BRV 臨床檢測

通過2%的瓊脂糖凝膠電泳分析，將本試驗建立的BRV RT-LAMP 檢測方法和普通RT-PCR 檢測方法分別對38 份臨床樣品進行檢測，如圖7 和圖8 所示，BRV 陽性率分別為47.4%和15.7%。結果證明RT-LAMP 檢測方法BRV 的陽性樣品檢出率高于普通RT-PCR 檢測方法。

圖7 部分腹瀉樣品RT-PCR 檢測BRV 的結果

圖8 部分腹瀉樣品RT-LAMP 檢測BRV 的結果

3 討論

隨著養牛業規模的不斷擴大，犢牛輪狀病毒感染率不斷上升[6]，導致犢牛出現大量急性傳染性腸道疾病，表現為腹瀉、脫水等癥狀，甚至死亡，給牛場和養殖戶帶來巨大的經濟損失。犢牛腹瀉病因復雜，傳染性病原包括病毒、細菌和寄生蟲等，其中輪狀病毒是引起犢牛腹瀉的最主要病原之一。普通RT-PCR 檢測輪狀病毒，由于時間長、操作復雜，需要專業人員、專業設備來進行操作和運行，并不利于基層牧場或獸醫人員進行現場快速檢測。LAMP 作為一種新型的核酸擴增技術，已逐漸發展成為一種成熟可靠的分子生物學診斷方法，它突出的優勢使其在一些國家和地區的病原檢測中發揮著重要作用[15]。由于LAMP 在等溫條件下擴增，較普通PCR 的三溫度循環更簡便，且擴增速度要快于普通PCR，故LAMP 用時短、易操作、無需高昂的精密儀器，更有利于現場的快速檢測。近幾年，研究者基于LAMP 技術開發出了納米金-LAMP、LAMP-ELISA、電化學生物傳感器-LAMP 和數字核酸-LAMP 等方法，提高了LAMP 的特異性和高效性[16]。

本試驗通過對RT-LAMP 反應體系的Mg2+（100 mmol/L）、dNTPs（10 mmol/L）、內引物的用量以及反應條件時間和溫度進行優化，建立了一種能夠快速檢測BRV 的RT-LAMP 方法。由于LAMP 擴增中使用的外引物用量較高，可導致一些引物二聚體或不匹配的情況出現，在LAMP 擴增期間出現假陽性的結果，故本試驗嚴格按照LAMP 引物設計的原則，特別注意引物的Tm值、引物末端的穩定性、GC 含量和引物之間的距離[17]來設計引物。RT-LAMP 方法還容易引起交叉污染，本試驗通過對實驗室嚴格分區，試劑進行分裝，嚴禁隨意丟棄試驗垃圾以避免交叉污染。范晴等[11]建立的檢測BRV 的二重熒光RT-LAMP 方法，與本試驗建立的方法敏感性一致，均有反應條件簡單、特異、敏感、快速和穩定等優點。李巍等[18]建立的檢測BRV 的RT-LAMP 方法，在等溫條件下只需要50 min 就能檢測出結果，并能特異地檢測BRV，但是未見該方法應用于臨床樣品的檢測。本試驗的RTLAMP 檢測方法經優化后，敏感性與普通PCR 相比提高了10 倍。在38 份臨床樣品檢測中，RT-LAMP 和普通RT-PCR 方法監測BRV 的陽性率分別為47.4%和15.7%，結果表明，該BRV RT-LAMP 檢測方法具有更高的檢出率，可以滿足快速檢測的需要，并且本研究所采用的SYBR GreenⅠ染色方法操作簡便、易于觀察，為牛輪狀病毒的現場快速檢測提供技術支持。

綜上所述，本試驗建立的檢測牛輪狀病毒的RTLAMP 方法，具有快速、簡便、靈敏度高和特異性強等特點，為基層牧場和專業實驗室進行牛輪狀病毒檢測提供了技術支撐。