一例安格斯肉牛巴貝斯蟲病的診斷與治療

劉秀娟，張梅梅

（準格爾旗農牧局，內蒙古 鄂爾多斯 010300）

1 前言

1.1 病原

寄生蟲病對全球公共衛生有著深遠影響。據世界衛生組織2020 年全球衛生統計報告，傳染病和寄生蟲病是導致動物死亡的主要原因之一[1]。目前寄生蟲主要分為體內寄生蟲和體外寄生蟲，而體外寄生蟲也是動物最易感的原蟲之一[2]。巴貝斯蟲病是一種全球性的人畜共患病，對人和動物的健康及養殖經濟效益有重大影響[3]。該寄生蟲主要寄生在生物的紅細胞內，并且有高度的宿主特異性。迄今為止，已鑒定出100多類不同的物種均可被感染，并且這種寄生蟲的宿主有向人類發展的趨勢。有報道稱，英國有一例患者因感染該寄生蟲導致死亡[4]。研究表明，在過去20～30 年中，該寄生蟲感染牛的病例越來越多，且成為制約肉牛養殖業發展的一個主要原因[5]。

巴貝斯蟲體多為環形、梨形等，主要寄生在紅細胞中，會侵襲宿主血液循環系統，因而巴貝斯蟲病成為肉牛養殖中一個值得關注的問題。該疾病雖然死亡率較低，但會造成動物慢性消耗，使肉牛逐漸消瘦，養殖成本不斷增加[6]。受感染的牛會出現發熱、厭食、血紅蛋白尿（俗稱“紅水”）及貧血等癥狀，少數病例還會出現神經癥狀和死亡現象[7]。

目前巴貝斯蟲的主要傳播媒介為硬蜱，該寄生蟲寄生于硬蜱體內，硬蜱再寄生于其他動物體表通過吸血將巴貝斯蟲卵傳播到宿主血液中，使宿主感染巴貝斯蟲。懷孕的母畜感染該寄生蟲后還會經卵巢垂直傳播給胎兒，造成胎兒感染[8]。垂直傳播這一現象增加了人類對巴貝斯蟲病的控制難度，因為即使通過治療將巴貝斯蟲從宿主身上清除，但藥物無法通過胎盤屏障進入宿主胎兒體內，使得胎兒感染后無法治愈[9]。

1.2 診斷方法

目前，確定巴貝斯蟲感染的手段包括顯微鏡觀察?？蓪⒋龣z血液制成血涂片，然后對染色的血液涂片進行顯微鏡檢查，觀察紅細胞內是否含有梨狀體樣的寄生蟲。ELISA 試驗也可對巴貝斯蟲進行檢測鑒定[10]。此外，寄生蟲體中的18S 小亞單位（SSU）核糖體RNA 基因的PCR 擴增和測序技術也是一種用于寄生蟲檢測和物種鑒定的高靈敏度分子生物學方法[11]。該基因位于梨形體發育信息可變區，許多已發表的序列均有助于進行物種分類[12]。PCR 技術被證實比血清學檢測更靈敏，比起僅可提供被檢動物先前是否被病原感染的抗體反應，PCR 技術還可以直接檢測帶病動物體內的病原體[13]。

在英國，傳統上側重于確定風險地理區域后進行放牧管理，然后將小牛引入這些風險區域，以增強免疫力，從而促進當地地方病的穩定性[14]。這種方法依賴于公認的“牛巴貝斯蟲病反年齡抗性現象”，即1 歲以下的小牛對該病表現出自然(先天性)免疫[15]，感染的特點往往是低水平的寄生蟲血癥，可以持續很長時間。目前，英國牛的巴貝斯蟲病主要根據臨床癥狀以及農場和動物發病史進行診斷[16]。

2 病例診斷情況

2.1 病史調查

2022 年9 月，在內蒙古鄂爾多斯市準格爾旗某規?；笮腿馀ｐB殖場，獸醫人員例行巡查牛只狀態時發現某圈舍有14 頭牛精神沉郁、厭食且觸診體溫較高。截至發病前，該場肉牛存欄量為450 頭，其中患病牛14 頭，發病率為3.11%。該養殖場有1 棟隔離圈舍，5棟飼養圈舍，配備有自動飼養設備及清糞設備。圈舍整體干凈整潔，之前未出現過有相關癥狀的病例。

2.2 臨床癥狀

患病牛為進口安格斯肉牛，體溫均高于40.2 ℃，對外界刺激較為不敏感，仔細觀察體表發現有蜱蟲附著。經過臨床癥狀觀察疑似肉牛感染血液寄生蟲病，具體發病原因需要對血液進行詳細的實驗室檢測。

2.3 實驗室診斷

將患病牛只進行隔離飼養，頸靜脈采血2 mL，依次標記為1～14 號并將血樣送至實驗室進行處理及檢測。

2.3.1 血涂片檢測。在采集的14 管患病牛的血液樣品中加入0.2 mL 抗凝劑。分別吸取10 μL 抗凝血滴加到載玻片上，用另一塊載玻片從一邊輕輕地勻速推到另一邊，使血液均勻地覆蓋在載玻片上并在室溫下晾干。在晾干的血液涂片上滴加2 滴甲醇溶液進行固定，接著在血涂片上滴加100 μL 吉姆薩染色A 液靜置20 min，用等量pH 值為7.2 的磷酸鹽緩沖B 液與吉姆薩染色A 液混合靜置20 min 后用蒸餾水沖洗，再用濾紙吸干血涂片，置于光學顯微鏡上；滴加1 滴香柏油后用1 000×油鏡觀察血涂片。

由圖1 鏡下觀察到，紅細胞呈現不規則形狀，胞內有多個環形、梨形等形狀不一的蟲體，單一的蟲體整體長度約為紅細胞半徑的四分之一，多數位于紅細胞邊緣，有的紅細胞中有3 個以上的蟲體。血涂片鏡檢疑似牛巴貝斯蟲病，但具體的診斷還需進一步檢測。

圖1 血涂片鏡檢

2.3.2 ELISA 檢測。用抗凝血分離后的血漿進行牛巴貝斯蟲ELISA 檢測。吸取每個待測樣品中10 μL 血漿到酶標檢測板孔中，同時加設陰性、陽性及空白對照（每個對照設2 個重復防止出現誤差）封板，37 ℃放置20 min； 棄去廢液用PBS 洗滌3～5 次，再加入100 μL HRP 酶標抗體封板，37 ℃放置20 min；再棄去廢液用PBS 洗滌3～5 次，加入反應液（A 液、B液各50 μL）于37 ℃放置15 min；最后加入50 μL終止液 （需在10 min 內檢測），置于酶標儀內在OD420進行檢測。

結果如表1 所示，本次檢測值均大于閾值，顯示存在牛巴貝斯蟲抗體，為了進一步確診，需進行PCR試驗。

表1 牛巴貝斯蟲ELISA 檢測結果

2.3.3 18S rDNA PCR 檢測。提取待檢牛血漿中巴貝斯蟲的DNA，用特異性引物（表2）[15]進行18S rDNA的PCR 鑒定。反應條件為：94 ℃3 min；94 ℃30 s，56 ℃20 s，71 ℃30 s，30 個循環；73 ℃5 min[13]。PCR 產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后觀察結果（圖2）。

表2 牛巴貝斯蟲特異性引物序列表

圖2 18S rDNA PCR 擴增結果

將PCR 產物送至生物公司測序，測序完整序列結果如下所示。結果在NCBI 數據庫進行比對后，顯示與牛巴貝斯蟲同源性為99.9%，證明本例病因是牛巴貝斯蟲感染。

測序完整序列：atggaggctacaacaactgcaaaaacagggatatggaaaaaatatctcactttg gtggttcctatactatgtgtag tgattctttctggtgaagtggtacccacagaagc tgccttccaatacgtgaaaatgagccaaagcgcag aaccagccgtagagatg gtggaaggtcctcaaggagacaa actaccaactctcggttgtcagcggatatg atgacagtgacgatggtgatgattccg ataggcccagaggaaggcaacagtc ctccaaatctacgccgaaggat atctggggcagatacatgccaagtttgacctt gcgaaatcccacggttccggtatatacgtcgacctaggagggacagaaaggg ttggtgccacgcaacatcgtatgcccaccggtaagtgccccgtatgggtaagg tgattaacttgggaaacaatgcggacttcctcaaccgaatatccgccgaaaccc acaggacagaggtctggcatttcctgatacagcagttgcagtaactagaaatag caacgcaaggaatcgtgcggcggccgagaaaactgagattattctatcgcctg tgtccgcagcagaccttgtacggtggggctacgatggcaacgacgtcgccaa ctgcgccgagtatgccggcaatatcatacctgcttctgac acagcgcaaa gta caggtacccttgcgtatacgatgccaaggaggaaatgtgtcacatcct cttcac gcccatgcagtacaaccgaggtagtagatatt gtgacaatgatggatcccaag acgaggggacaagctccctcctgtgtatggagccgatgaagagcggcattga tgcacacctttactacggttcttcacgggtagataaaaaatgggaagaaaactg tcccatgtacccagttaaggatgctatctttgggaggggggccaattggacttgt tgtcgctattgagtccgctttcgaagaatttcacgcgtgacgcagaggagtgttc tgctcttatgttcgaaaacgcagcagctgatctcgaaatcgatgaggaagctga taacttcgatgaactgaagactc tatccgacggccttcggaacataaaggcctc caagattgctcaagcgctattctccccaatcgcgaaagcaggcacctcggcca aaaattccaagggagtaggaatgaactgggctaaactatgacagcaatactgg attgtgccgtgttatagaagaaactccaaactgcctcatcatagacgctggtagt tttg ccatgacagcagttggattcgcctctcgagcaggatgctgtcccgtttcca tgtgatatcgttactaacggctacattgagccccgcccgcgaagtcgccatagg aacactacgccaatatttgaagtcacaaccgcgctttcacgagaa。

3 治療方法

治療牛巴貝斯蟲病的原則是通過清除牛體內巴貝斯蟲，使紅細胞盡快恢復基礎代謝功能。本次治療選用的是三氮脒注射液（河北某獸藥業有限公司；產品批號：2020012；注射劑，1 g/支），牛肌內注射，1 次量為3 mg/kg，1 日1 次，間隔24 h 可再次注射，但不得超過3 次。3 d 后患病牛有了明顯好轉。10 d 后全部治愈，精神狀態、食欲以及體溫均恢復正常。

4 討論

4.1 防治

蜱蟲是巴貝斯蟲的中間宿主，經蜱蟲叮咬是巴貝斯蟲最常見的傳播途徑。蜱蟲具有明顯的季節性活動規律，多發生于每年的3—10 月。內蒙古的養殖場常選址于人煙稀少的荒灘，而這些地方也是蜱蟲較為活躍的區域，針對這些問題應制定一套有效的牛巴貝斯蟲防控措施。

首先要保持牛群飼養場區及圈舍衛生。將場區內的臭水溝等潮濕的地方用生石灰掩埋后再用泥土填平，以免天氣炎熱使得許多寄生蟲的中間宿主再次繁殖；每天清理圈舍糞便，對臥床上的墊料、料道及飲水系統要定期清洗消毒、檢查更換，以免時間長發霉滋生細菌[16]。清潔干凈的環境能讓動物處于一個舒適的狀態，從而提高機體對外界的抗病能力。

對牛群要定期驅蟲。寄生蟲寄生方式主要分為兩種：一種是體表寄生，另一種是體內寄生。體表寄生蟲更多是體內寄生蟲的一種傳播媒介，寄生蟲通過體表叮咬吸取血液獲得營養，同時也將其體內其他寄生蟲傳播到血液中。對此可在體表寄生蟲高發季節，在場區附近燃燒蒿草，通過煙霧達到驅蟲的目的。也可以選擇體表驅蟲藥（阿維菌素和伊維菌素等）進行藥浴或者口服，每年2 次[17]。對于體內寄生蟲則可以在其傳播媒介活躍時期，對牛群進行抽樣采血，通過簡單的血涂片法進行鑒定，檢查牛群血液中是否有蟲體的存在。當有新的牛只購入時，首先要采血檢測是否存在寄生蟲，并對牛只進行體表驅蟲，集中隔離飼養45 d 并檢疫合格后再進行合群飼養[18]。

4.2 診斷

顯微鏡檢查是診斷寄生蟲病最常用的方法之一。然而，用顯微鏡對寄生蟲識別和量化耗時且勞動密集，許多養殖場缺乏顯微鏡及具有相關技術的研究人員，以至于無法及時診斷體內寄生蟲的種類，而引發驅蟲藥的濫用，因此更為方便、快捷以及成本低廉的診斷方法是獸醫工作者研究的目標[19]。本次病例診斷中，除了顯微鏡檢查外，還使用了血清學方法的ELISA 檢測和分子生物學診斷的18S rDNA PCR 技術。后兩種方法相對于顯微鏡檢查能更有效地應用于臨床實踐診斷中，且結果更加準確[20]，能夠輔助肉牛養殖場及時診斷并進行驅蟲。

5 結論

通過對本次報告肉牛病例進行臨床癥狀觀察及實驗室診斷，最終確診為牛巴貝斯蟲感染，并采用三氮脒治愈了該病。