比較5種消毒劑對4種細菌的殺菌效果

劉志國 董 浩 劉銘赫 李林嬌 馬麗穎

(1.中國食品藥品檢定研究院,北京 102629)(2. 中國獸醫藥品監察所,北京 100081)

實驗動物設施按照潔凈度,可以分為普通環境設施、屏障環境設施和隔離環境設施。其中,屏障環境設施和隔離環境設施對病原微生物都有著嚴格的控制要求。根據國家標準《實驗動物 環境及設施》(GB 14925—2010)的相關要求,屏障環境設施的空氣潔凈度要達到7級,飼養無菌動物和免疫缺陷動物的隔離環境設施的空氣潔凈度更是要達到5級。

致病性微生物一旦侵入屏障環境設施和隔離環境設施,可能引起實驗動物的感染、發病,干擾動物實驗結果,甚至威脅工作人員身體健康等一系列不良后果。做好日常消毒工作是保障實驗動物設施潔凈度的重要手段之一[1]。

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、沙門氏菌是SPF級小鼠、大鼠、豚鼠和兔均必須排除的細菌性病原。為了研究目前常用的新潔爾滅消毒液、健之素消毒泡騰片、百毒殺消毒液、百勝-30(碘酸混合溶液3.0%)、75%乙醇等5種消毒劑對于上述病原微生物的殺滅效果,參考國家標準《消毒劑實驗室殺菌效果檢驗方法》(GB/T 38502—2020)設計了相應的實驗方案進行了消毒劑殺菌效果的實驗驗證。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1菌株:金黃色葡萄球菌(CVCC4098)、銅綠假單胞菌(CVCC2000)、肺炎克雷伯菌(CVCC4079)和鼠傷寒沙門氏菌(CVCC2220)均購自中國獸醫藥品監察所。

1.1.2試劑與耗材:新潔爾滅消毒液【消毒液原液的苯扎溴銨含量為2.7%～3.3%(W/V)】(山東安捷高科消毒科技有限公司);健之素消毒泡騰片(北京長江脈醫藥科技有限責任公司),有效氯含量為(35.0±3.5)%;百毒殺消毒液(癸甲溴銨溶液,規格為100 mL∶10 g)(上海派斯德生化有限公司);百勝-30(碘酸混合溶液3.0%)由Evans生產廠生產,成分為醇乙氧基化物20%～25%,硫酸5%～10%,磷酸5%～10%,碘1%～3%;75%乙醇(北京鴻志偉達工貿有限公司);胰酪大豆胨液體培養基(Trypticase Soy Broth,TSB)、D/E中和肉湯培養基和吐溫80(青島高科技工業園海博生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1工作濃度消毒劑的配置:百毒殺消毒液:25 μL的百毒殺原液加入15 mL蒸餾水中,即將百毒殺原液進行600倍稀釋;健之素消毒液:1片健之素泡騰片(250 mg)加入500 mL蒸餾水中,混勻;新潔爾滅消毒液:按照使用說明將新潔爾滅消毒液原液與蒸餾水按照1∶4的比例混合;75%乙醇:直接使用產品原液;百勝-30消毒液:將100 μL百勝-30消毒液原液加入10 mL的蒸餾水中,配置成1%濃度的溶液;1∶200稀釋百毒殺消毒液:50 μL的百毒殺原液加入10 mL蒸餾水中;1∶100稀釋百毒殺消毒液:100 μL的百毒殺原液加入10 mL蒸餾水中。

1.2.2菌懸液的制備:將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和鼠傷寒沙門氏菌劃線接種于胰酪大豆胨固體培養基,37 ℃溫箱過夜培養。挑取菌落形態正常的單菌落,接種于10 mL TSB液體培養基中,置于37 ℃搖床中,200 r/min振蕩培養12 h。使用無菌0.9%氯化鈉溶液對細菌進行倍比稀釋并計數。將各組細菌的濃度統一稀釋至1×109CFU/mL。

1.2.3中和劑鑒定實驗:為了驗證D/E中和肉湯培養基針對每種消毒劑中和效果,參考《消毒劑實驗室殺菌效果檢驗方法》(GB/T 38502—2020),略有改動。依次分成兩個實驗組進行驗證。實驗組1(對照組)為0.4 mL無菌0.9%氯化鈉溶液與4.5 mL的D/E中和肉湯培養基混勻,室溫孵育5 min后,加入0.1 mL的菌懸液,混勻后靜置10 min,隨后進行細菌計數。實驗組2(中和組)為0.4 mL消毒液與4.5 mL的D/E中和肉湯培養基混勻,室溫孵育5 min后,加入0.1 mL的菌懸液,混勻后靜置10 min,隨后進行細菌計數。同時對所使用的0.9%氯化鈉溶液和D/E中和肉湯培養基各取200 μL進行涂板,驗證其未被細菌污染。

1.2.4懸液定量殺菌實驗:取0.3 mL的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和鼠傷寒沙門氏菌懸液分別加入1.2 mL工作濃度的百毒殺消毒液、健之素消毒液、新潔爾滅消毒液、百勝-30消毒液和75%乙醇中,混勻后室溫孵育1.5、5、10和30 min。隨后,分別取出0.5 mL的上述混合液加入4.5 mL的D/E中和肉湯培養基,并進行充分混勻。室溫放置10 min后,進行細菌計數。上述實驗重復3次。

1.2.5結果判定:參考《消毒劑實驗室殺菌效果檢驗方法》(GB/T 38502—2020)進行中和劑的中和效果及消毒劑的殺菌效果判定。在中和劑與稀釋液無菌驗證成立的前提下,兩組之間細菌計數菌落數誤差率<15%,則證明中和劑有效。懸液定量殺滅實驗中,指定時間內消毒液各次重復的殺滅對數值均≥5.00,證明殺菌效果合格,否則判定為不合格。

2 結果

2.1 D/E中和肉湯培養基中和效果的鑒定

將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和鼠傷寒沙門氏菌培養12 h后稀釋至1×109CFU/mL,測試D/E中和肉湯培養基對工作濃度的百毒殺消毒液、健之素消毒液、新潔爾滅消毒液、百勝-30消毒液和75%乙醇的中和效果。根據《消毒劑實驗室殺菌效果檢驗方法》(GB/T 38502—2020)的要求,對照組與中和組之間的菌落數偏差均小于15%,說明D/E中和肉湯培養基對于上述5種消毒液均有良好的中和效果。

2.2 不同消毒液對金黃色葡萄球菌的殺菌效果

測試5種消毒液在室溫下對金黃色葡萄球菌的殺菌效果,如表1所示。除了百毒殺消毒液(1∶600倍稀釋)外的其他4種消毒液在作用1.5、5、10和30 min后,取200 μL涂板,經過16～24 h培養,培養基上沒有任何菌落生長?？紤]到細菌在加入消毒液和加入中和劑后共被稀釋了50倍,所以當平板無細菌生長時表明經過消毒的細菌濃度小于2.5×102CFU/mL。此時,殺菌對數也大于5,說明這4種消毒劑可以在1.5 min有效殺滅金黃色葡萄球菌。

表1 各種消毒液對金黃色葡萄球菌的殺菌效果Table 1 The bactericidal effect of various disinfectants on Staphylococcus aureus

百毒殺消毒液(1∶600倍稀釋)在1.5 min和5 min兩個時間點均無法完全殺滅金黃色葡萄球菌,殺菌對數也小于5,說明在5 min內百毒殺消毒液(1∶600倍稀釋)無法有效殺滅金黃色葡萄球菌。

2.3 不同消毒液對綠膿桿菌的殺菌效果

測試5種消毒液在室溫下對銅綠假單胞菌的殺菌效果,如表2所示。健之素消毒液、新潔爾滅消毒液、百勝-30消毒液和75%乙醇4種消毒液在作用1.5、5、10和30 min后取200 μL涂板,經過16～24 h培養,培養基上沒有任何菌落生長,說明此時細菌的濃度小于2.5×102CFU/mL。此時,殺菌對數也大于5,說明這4種消毒劑可以在1.5 min有效殺滅綠膿桿菌。

表2 各種消毒液對銅綠假單胞菌的殺菌效果Table 2 The bactericidal effect of various disinfectants on Pseudomonas aeruginosa

百毒殺消毒液(1∶600倍稀釋)在作用30 min內無法完全殺滅銅綠假單胞菌,1.5、5、10和30 min各個時間點的殺菌對數均小于5,說明該稀釋濃度下的百毒殺消毒液對銅綠假單胞菌的消毒效果不理想。

2.4 不同消毒液對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果

測試5種消毒液在室溫下對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果,如表3所示。健之素消毒液、新潔爾滅消毒液、百勝-30消毒液和75%乙醇4種消毒液在作用1.5、5、10和30 min后,取200 μL涂板,經過16～24 h培養,培養基上沒有任何菌落生長,說明此時細菌的濃度小于2.5×102CFU/mL。此時,殺菌對數也大于5,說明這4種消毒劑可以在1.5 min有效殺滅鼠傷寒沙門氏菌。

表3 各種消毒液對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果Table 3 The bactericidal effect of various disinfectants on Salmonella typhimurium

百毒殺消毒液(1∶600倍稀釋)在1.5 min無法完全殺滅鼠傷寒沙門氏菌,殺菌對數小于5,說明在1.5 min百毒殺消毒液(1∶600倍稀釋)無法有效殺滅鼠傷寒沙門氏菌。

2.5 不同消毒液對肺炎克雷伯菌的殺菌效果

測試5種消毒液在室溫下對肺炎克雷伯菌的殺菌效果,如表4所示。健之素消毒液、新潔爾滅消毒液、百勝-30消毒液和75%乙醇4種消毒液在作用1.5、5、10和30 min后,取200 μL涂板,經過16～24 h培養,培養基上沒有任何菌落生長,說明此時細菌的濃度小于2.5×102CFU/mL。此時,殺菌對數也大于5,說明這4種消毒劑可以在1.5 min有效殺滅肺炎克雷伯菌。

表4 各種消毒液對肺炎克雷伯菌的殺菌效果Table 4 The bactericidal effect of various disinfectants on Klebsiella pneumoniae

百毒殺消毒液(1∶600倍稀釋)在1.5 min無法完全殺滅肺炎克雷伯菌,殺菌對數小于5,說明在1.5 min百毒殺消毒液(1∶600倍稀釋)無法有效殺滅肺炎克雷伯菌。

2.6 不同濃度百毒殺消毒液對銅綠假單胞菌的殺菌效果

為了測試是否高濃度的百毒殺消毒液對綠膿桿菌具有較好的殺滅效果,分別配置了1∶100倍稀釋和1∶200倍稀釋的百毒殺消毒液,與1×109CFU/mL在作用1.5、5、10和30 min后,取200 μL涂板,經過16～24 h培養。結果如表5所示,提高百毒殺的濃度后,對于綠膿桿菌的殺滅效果有明顯提升。盡管1∶200倍稀釋和1∶100倍稀釋的百毒殺在1.5 min內不能完全殺滅銅綠假單胞菌,但是殺菌對數均已經大于5,符合《消毒劑實驗室殺菌效果檢驗方法》(GB/T 38502—2020)的要求。

表5 不同濃度百毒殺消毒液對銅綠假單胞菌的殺菌效果Table 5 The bactericidal effect of different concentrations of Didecyl dimethyl ammonium bromide solution on Pseudomonas aeruginosa

3 討論

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、沙門氏菌是SPF級小鼠、大鼠、豚鼠和兔均必須排除的細菌性病原。在前期的研究表明,這4種細菌在SPF級實驗動物中均有一定比例的流行,其中金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌在實驗動物中的檢出率較高。在2011—2017年的145份SPF級大鼠的回盲內容物中金黃色葡萄球菌的檢出率達到21.38%[2]。2008—2017年在北京地區實驗大鼠中檢測到金黃色葡萄球菌165株,陽性率為8.44%[3]。2008—2011年對北京地區實驗動物綠膿桿菌的檢測發現,小鼠、大鼠、豚鼠和兔的檢出率為6.6%～9.7%[4]。

正確的開展實驗動物設施的消毒工作,是有效控制病原微生物滋生的重要手段。目前可供選擇的消毒劑種類繁多,如按照化學性質分類,可以分為鹵化物類消毒劑、過氧化物類消毒劑、季銨鹽類消毒劑、醇類消毒劑、醛類消毒劑、酚類消毒劑等[1]。在前期的研究中,對于實驗動物設施中消毒劑的選擇也已經有不少的文獻報道,但是大多數文獻都專注于介紹了消毒劑的種類、性質、作用機制、毒性以及對模式菌株的殺菌效果[1,5-8]。

不同類型消毒劑針對特定的SPF級實驗動物必須排除病原的消毒效果的研究比較有限。抑菌環實驗研究發現0.1%的新潔爾滅、有效氯含量為0.4%的84消毒液、0.4%濃度的洗必泰對沙門氏菌具有完全抑制作用[9]。有抑菌環實驗研究了6種常用消毒劑對沙門氏菌和大腸埃希菌的殺滅效果,發現0.05%古迪安對沙門氏菌和大腸埃希菌的抑菌作用效果最好,其次是0.05%百毒殺和0.25%戊二醛溶液,0.2%過氧乙酸、0.1%二氯異氰脲酸鈉粉和0.25%新潔爾滅抑菌效果較差[10]。有研究采用了薄膜過濾法驗證了0.2%新潔爾滅和5%甲酚皂消毒液可以有效殺滅金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉[11]。本研究采用的是《消毒劑實驗室殺菌效果檢驗方法》(GB/T 38502—2020)中的懸液定量殺菌實驗進行消毒劑的殺滅效果評價,由于在測試過程中使用了中和劑對消毒劑進行即時中和,所以可以比較精確地確定不同消毒劑在特定濃度下殺滅細菌的最短時間。在本研究中,健之素消毒液(500 mg/L)、新潔爾滅消毒液(含0.54%～0.66%苯扎溴銨)、1%的百勝-30消毒液和75%乙醇4種消毒液均可以在1.5 min將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、沙門氏菌進行有效殺滅。1∶600倍稀釋的百毒殺無法在1.5 min內對上述4種細菌進行有效殺滅,需要延長消毒作用的時間。而對于銅綠假單胞菌,1∶600倍稀釋百毒殺的殺滅效果較差,當百毒殺濃度提高至1∶200和1∶100倍稀釋后,才可以有效殺滅綠膿桿菌,因此建議在屏障設施的日常消毒過程中,使用1∶200倍稀釋濃度的百毒殺進行消毒。

值得注意的是,由于評價消毒劑效果的不同研究中采用的評價方法并不相同,細菌濃度、消毒液工作濃度、是否使用中和劑、細菌與消毒液作用比例和作用時間等細節上也有出入,所以不同研究的實驗結果可能出現一定的不一致性。在后續研究中,有必要采用不同的評價方法對消毒劑的殺菌效果進行平行驗證。

本研究測試了5種消毒劑對4種SPF級實驗動物必須排除的細菌的消毒效果,為實驗動物設施內消毒劑的選擇,以及日常消毒劑使用效果評價,提供了一定的數據參考。