嚙齒類動物抑郁相關行為學評價*

盧宇佳 張 珊 趙 謙 王安娜 李 麗 趙靜潔

(首都醫科大學附屬北京友誼醫院,北京 100050)

抑郁癥又稱抑郁障礙,以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征,是心境障礙的主要類型。世界衛生組織預測,2030年抑郁癥將成為最大的健康挑戰[1]。研究者嘗試建立穩定的抑郁相關動物模型,用于其機制研究及開發治療藥物。嚙齒類動物價格低廉、繁殖迅速、取材簡便。造模后出現的一般活動狀態的改變、對新鮮環境的好奇程度及探索能力下降、快感喪失等特征,與抑郁癥精神運動性變化相似。因此為抑郁相關模型的常用動物選擇。

在過去的50年中,抑郁相關動物模型的構建推動了抑郁癥病理生理學研究,促進了抗抑郁藥物的開發。抑郁相關動物模型構建最初基于手術方法(例如嗅球切除術)或急性應激誘導。近年來研究表明,與短期急性應激相比,慢性長期應激,如慢性束縛應激、慢性社會挫敗應激和慢性不可預知的溫和刺激似乎可以模擬人類在日常生活中接受的不良應激事件,更加有效構建了抑郁癥動物模型[2]。判斷這些模型是否造模成功,抗抑郁藥物是否有效的評價方法主要基于行為學實驗。常用的行為學實驗主要分為:檢測絕望情緒的實驗,如強迫游泳實驗、懸尾實驗[3]?；讵勝p的實驗,如糖水偏好實驗、新奇抑制攝食實驗[4]?；谔剿餍袨榈膶嶒?如曠場實驗、高架十字迷宮實驗、明暗箱實驗[5]。然而目前關于行為學評價操作方法不統一,為使其對抑郁癥模型評價的準確度更高,本文基于絕望、獎賞、探索三個方面對嚙齒類動物抑郁相關行為學評價方法進行全面疏理,總結如下:

1 資料來源和檢索策略

作者于2021年10月在中國知網(CNKI)、萬方數據知識服務平臺、National Center for Biotechnology Information(PubMed)數據庫進行檢索;其中檢索式為“主題+自由詞”,抑郁(depression or depressive-like)AND行為學(behavior)AND嚙齒類動物(rodent or rat or mouse),共檢索出438篇相關文獻。

2 文獻納入標準和排除標準

納入標準:(1)涵蓋抑郁癥動物行為學評價的相關文獻;(2)2010年12月至2021年10月公開發表的期刊文獻;(3)研究設計完整的文獻。

排除標準:(1)綜述等二次評價類文獻;(2)抑郁癥合并其他疾病的文獻;(3)用于評價其他精神類疾病的文獻;(4)行為學評價流程或結果描述不清;(5)所涉及行為學方法使用頻率較低。

3 質量評估與數據提取

本次綜述最后納入文獻196篇,約2/3文獻是近5年內的,如同一研究團隊發表,中英文觀點一致,選擇文獻質量較高的納入。納入的文獻著重闡述抑郁相關動物模型的行為學評價相關研究。因行為學評價方法較多,操作流程不一,僅作定性描述(圖1)。

圖1 文獻篩選流程圖Fig.1 Flow chat of literature screening

4 文獻研究結果

4.1 行為學檢測方法

嚙齒類動物行為學檢測,在精神類疾病研究中具有重要意義。通過觀察嚙齒類動物行為學變化,結合現代臨床中精神疾病的癥狀,加深人類對精神類疾病的探索和藥物的研發。由于行為學檢測目的不同,各實驗室選擇的組合方式不盡相同,本文基于絕望、獎賞、探索三個方面,對所納入文獻中涉及的行為學檢測方法出現頻率進行了統計(表1)。

4.2 基于絕望的行為學檢測方法

4.2.1強迫游泳實驗(forced swimming test,FST):早在1977年法國學者Porsolt發明了該實驗并將其用于行為絕望的抑郁模型造模[6]。嚙齒類動物因無法脫離困境,放棄掙扎的行為表現,屬于“行為絕望”。此種行為不僅是身體能量或運動減少的反應,而且表明動物的精神活動水平。FST可以較好的模擬抑郁障礙患者的絕望感,在抑郁癥研究中應用廣泛[7]。

根據對各團隊發表文獻查閱,現總結基本流程如下:實驗前應排除游泳能力不佳的動物。小鼠/大鼠適應性游泳時間為10～15 min,適應后將小鼠/大鼠置于濕度45%～65%,溫度21～23 ℃的實驗環境中,間隔24 h進行正式實驗。如圖2所示,選擇往圓柱體(大鼠和小鼠所需高度分別約為50、30 cm,直徑分別約為30、20 cm)水缸中注水,液面高度以鼠尾不能碰觸為宜。適應后,將動物放入水中并記錄,小鼠/大鼠記錄時間為5～10 min(部分實驗團隊將動物放入水中10 min,記錄后4～5 min游泳不動時間)。記錄后撈出吹干,恢復體溫,每只動物交換時換水[8]。實驗動物維持漂浮狀態:身體微蜷,只露出鼻孔維持呼吸,前爪停止刨水,后爪偶有劃水,定義為“靜止時間”,靜止時間長的動物為絕望行為明顯[9],抑郁表型鮮明。

注:A.強迫游泳實驗中小鼠掙扎狀態;B.強迫游泳實驗中小鼠靜止狀態。Note: A.Struggling state of mice in the FST;B.Stationary state of the mice in the FST.

實驗環境、水溫是影響該實驗結果的重要因素,因此該實驗需注意的是:(1)由于實驗光線較強,會縮短嚙齒類動物不動時間,不利于準確反映其抑郁狀態[9],因此FST實驗應在不超過0.96 W/m2環境下進行[10]。(2)水溫是FST重要影響因素之一,研究表明,水溫與靜止狀態呈U型關系,水溫過低或過高則會縮短不動時間,故宜控制在20～25 ℃[12]。

4.2.2懸尾實驗(tail suspension test,TST):1985年Steru等[13]提出懸尾實驗,用于建立行為絕望模型?，F代研究認為,TST可用于廣泛測定廣譜抗抑郁藥的作用效果,價格低廉且方法簡單,易于自動化。嚙齒類動物由于尾端倒懸,產生劇烈掙扎,一段時間后因不能擺脫,出現不動狀態,此狀態類似抑郁癥患者的絕望行為[14]。

通過總結文獻了解,各實驗團隊實驗時將小鼠置于12 h/12 h晝夜間斷照明,濕度45%～65%,溫度21～23 ℃的實驗環境中,用膠帶將小鼠的尾端懸掛在與地板距離為 20～25 cm的懸掛桿上。實驗動物較多時,為防止動物彼此觀察或互相影響,中間用隔板隔開;動物懸掛在隔間中間,寬度和深度足夠大,不能與墻壁接觸。如圖3所示,當小鼠在懸掛時表現出的無掙扎狀態視為不動時間,記錄時常為5～10 min(部分實驗團隊實驗進行10 min,記錄后4～5 min的不動時間)。不動時間長的小鼠絕望行為明顯。

注:A.懸尾實驗中小鼠掙扎狀態;B.懸尾實驗中小鼠靜止狀態。Note: A.Struggling state of mice in the TST;B.Stationary state of the mice in the TST.

TST原理與FST原理相近,在眾多實驗團隊發表的文章中,其實驗結果也具有一致性[15]。然而,TST實驗結果依賴于嚙齒類動物的運動行為,不同品系的嚙齒類動物對實驗有較大影響。如大鼠體型較大,懸尾時可上翻,不適用于TST。也有實驗團隊認為C57BL/6小鼠存在沿著尾巴上爬的趨勢,對TST測試結果影響較大[16]。因此為避免因品系不同對實驗結果造成影響,應在實驗前,測量實驗動物尾巴占總體長度的百分比,以確定其爬上尾巴的程度,將上爬趨勢明顯的實驗動物在數據中排除,以免對數據造成干擾。

4.3 基于獎賞的行為學檢測方法

4.3.1糖水偏好實驗(sucrose preference test,SPT):1981年,Katz等[17]首次在抑郁癥動物造模過程中發現,應激后的模型鼠在SPT實驗中,消耗量減少了50%。Willner P等[18]發現內源性抑郁癥的核心特征是獎勵機制缺陷和快感缺乏。SPT因其有效的模擬了抑郁癥患者快感缺乏的臨床表現,被廣泛應用于抑郁動物模型造模成功與否的評價[19]。

根據現有文獻總結實施步驟如下:將嚙齒類動物置于12 h/12 h晝夜間斷照明,濕度45%～65%,溫度21～23 ℃的實驗環境中單籠飼養(小鼠多采用長×寬×高約為10 cm×24 cm×13 cm,大鼠采用38 cm×32 cm×18 cm),可自由接觸糖水瓶與白水瓶。在籠具上方放置瓶A、瓶B(瓶A為1%～2%蔗糖,瓶B為無糖飲用水)進行12～24 h實驗裝置適應,實驗動物可自由進食。適應結束,禁食禁水12～24 h后,進行測試,實驗動物給予瓶A與瓶B測量12～24 h。瓶A與瓶B測試前后都需稱重。飲糖水比率根據公式A/(A+B)×100%計算[20]。

部分實驗團隊認為,實驗動物糖水消耗量占總飲水量的比率<60%,則該動物有快感缺失。也有部分實驗團隊進行SPT實驗時,糖水消耗量占總飲水量的比率>60%。這可能與實驗適應時間、實驗環境、糖水濃度等關系密切。因此實驗時應注意:(1)實驗前應進行“兩瓶水裝置”適應性喂養,以降低突然增加裝置動物不能識別造成的實驗偏差。(2)正式實驗前應基線測量,排除個體差異(例如,個體天生不喜愛糖水而影響整體糖水偏愛率的評估)[21]。(3)如是禁水24 h后進行該實驗,應測試24 h的糖水消耗量,因為1 h測試方法會使禁水動物因口渴而選擇就近原則,不一定表現出偏愛糖水行為。(4)根據動物喜好,蔗糖濃度可在1%～2%變化,但實驗研究表明2%濃度實驗結果明顯優于1%[3]。

4.3.2新奇攝食抑制實驗(novelty suppressed feeding test,NSF):NSF實驗依據禁食后嚙齒類動物在新奇環境攝食潛伏期延長的原理,測量其在新環境的進食潛伏期,評估動物的抑郁狀態。NSF表現了嚙齒類動物攝食的消沉程度及焦慮水平。嚙齒類動物攝食的渴望和對新奇空間的懼怕兩者之間的矛盾競爭,使得該實驗能夠有效反應臨床中抑郁癥患者的快感缺失[22]。

實驗前,模型動物置于12 h/12 h晝夜間斷照明,濕度45%～65%,溫度21～23 ℃,可自由活動的實驗環境中,禁食不禁水12～24 h。準備一定尺寸(小鼠多采用長×寬×高約為50 cm×40 cm×30 cm,大鼠采用70 cm×70 cm×50 cm)曠場箱,曠場中央放置7～8 g的鼠糧,將動物沿箱子一角放入,記錄5 min內成功覓食所花費的時間及啃食食物的總重量。動物的攝食潛伏期越長,則表示焦慮程度越高。

通過總結文獻,環境因素對該實驗具有較大影響。(1)實驗過程中,應盡量實驗環境安靜,最大程度減少噪音對嚙齒類動物的影響。(2)為了順應嚙齒類動物的攝食習慣,應選擇較暗的實驗環境,光照應在0.12 W/m2左右。(3)該實驗需排除因為食欲差異而導致影響進食時間,故在模型動物放回籠中后需要記錄5～10 min的食物消耗量。(4)為保證實驗準確,在每次實驗前應校準天平,清除天平上食物碎屑并擦拭干凈。此實驗可多次重復,為避免動物熟悉環境,而違背此實驗原理,兩次實驗間隔時間應大于5 d。

4.4 基于探索的行為學檢測方法

4.4.1曠場實驗(open field test,OFT):Hall等在1934年首次將OFT測試應用于動物情緒研究中[23]。其原理基于嚙齒類動物畏懼空曠場地的天性,即其活動具有趨避性,對新事物易產生好奇性。OFT作為嚙齒類動物抑郁焦慮狀態的行為學評價方法,已推廣到神經學及精神藥理學的研究中。

主要操作流程為:大小鼠曠場裝置不同(小鼠曠場一般為30～50 cm長的正方形,深30 cm;大鼠曠場一般為小鼠兩倍,60～100 cm,深30 cm)。如圖4所示,曠場周圍由黑色不透明擋板圍成,并配有攝像頭,曠場中心邊界到外周的距離為總距離的20%或25%,即紅色方格區域為中心區,黑色方格區域為外周區域。測試時應提前30 min,把模型動物放置在測試房間適應,周圍環境參數為12 h/12 h晝夜間斷照明,實驗光照強度不超過0.12 W/m2,濕度45%～65%,溫度21～23 ℃。適應結束,把動物放入曠場中心,同時開始視頻記錄,測試過程5～10 min。測試結束,軟件追蹤并記錄嚙齒類動物在曠場中心區及外周區停留時間。

注:圖中所示長寬為小鼠裝置所用,中心邊界至外周距離比總距離,A為20%,B為25%。Note: The length and width shown in the figure are for the mice device, and the distance from the center boundary to the periphery is 20% for A and 25% for B.

通過對不同文獻的查閱總結,在具體操作中應注意如下幾點:(1)實驗中需保持安靜環境,以免噪音干擾,使模型動物產生緊張的情緒。(2)曠場需清潔除味,防止模型動物因嗅到同類的氣味而產生警覺性。(3)基于嚙齒類動物嗜暗的特性,應注意曠場亮度,使模型動物更接近其自然天性,增加實驗結果的準確性。

4.4.2高架十字迷宮實驗(elevated plus maze,EPM):EPM基于嚙齒類動物對新異環境產生的探究性和對高懸敞開臂產生的恐懼心理的特點,利用二者所形成的矛盾沖突行為考察其焦慮狀態。EMP能有效反映臨床中患者的焦慮狀態,被廣泛用于精神類藥物藥理研究,可有效評估抗焦慮藥物的藥理效應[24]。

測試前1周,應把模型動物放置在測試房間中進行適應,周圍環境參數為12 h/12 h晝夜間斷照明,溫度21～23 ℃,濕度45%～65%,自由飲用食水。如圖5所示,實驗者通常將小鼠置于長寬約為50 cm×10 cm的兩對相對開放臂(大鼠的開放臂長度多>45 cm、寬度為10或15 cm)和長寬高分別約為50 cm×10 cm×40 cm的兩對相對閉合臂(大鼠閉合臂的長寬與開放臂相同)及10 cm×10 cm連接成的中央區(大鼠多為15 cm×15 cm或10 cm×10 cm)[25]。記錄實驗動物放置于中心區后5～10 min內行為變化,目前多采用進入開放臂次數/時間百分比作為判定結果。

注:圖中所示裝置長度均為小鼠所用,A為高架十字迷宮結構圖,B為小鼠運動模式圖。Note: The length of the device shown is used by mice, A is the structure of the elevated plus maze, B is the movement pattern of the mouse.

參考各研究團隊實驗結果,在操作過程中應考慮以下幾點:(1)模型動物初始擺放位置較為關鍵,目前多認為應將其放在中央連接區,頭朝向開放臂,使其陷入探究與回避的矛盾中,更有利于通過記錄開放臂的時間及次數客觀評價其焦慮程度。若頭朝向封閉臂,則使模型動物更傾向于躲避,在實驗全程不進入開放臂。(2)光照強度應保持統一,以便行為分析軟件能更好的追蹤動物[26]。筆者建議選擇燈光為25 W燈泡,置于中央區40 cm處照明。(3)實驗時間以5～10 min為宜,時間過短,動物尚未適應環境,時間過長則可能造成動物對開放環境新奇度降低。(4)兩次實驗之間應使用乙醇噴灑并擦拭迷宮箱,避免實驗動物氣味對實驗結果造成一定影響。(5)為精確實驗結果,可將此實驗重復2次,每次間隔1周。

4.4.3明暗箱實驗(light/dark box,LDB):LDB利用動物對強光線的厭惡感以及對新奇環境探究習性之間的矛盾沖突,廣泛用于評價嚙齒類動物的焦慮樣行為。實驗研究表明,嚙齒類動物明箱活動時間與穿梭次數差異,模擬了抑郁癥患者在臨床當中的抑郁焦慮樣行為。

測試前1周,應把模型動物放置于12 h/12 h晝夜間斷照明,溫度21～23 ℃,濕度45%～65%,自由飲用食水的實驗環境中。如圖6所示,明暗箱(小鼠多采用長×寬×高約為45 cm×45 cm×30 cm,大鼠采用62 cm×48 cm×51 cm),包括較寬闊的明箱區(小鼠采用30 cm×45 cm×30 cm,大鼠采用42 cm×48 cm×51 cm),較狹窄的暗箱區(小鼠采用15 cm×45 cm×30 cm,大鼠采用20 cm×48 cm×51 cm),兩箱體隔板中間存在通道,可允許實驗動物自由穿梭。實驗者將小鼠放置明箱區正中央,通過攝像系統記錄5～10 min內動物的行為變化,包括暗箱停留時間、垂直運動及穿梭次數[27]。

圖6 明暗箱實驗示意圖Fig.6 Diagram of light/dark box

在總結文獻后,我們應注意(1)LDB是基于嚙齒類動物天生對明亮區域的厭惡,以及嚙齒類動物對新環境的自發探索行為,應選擇30 W燈泡距離箱底45 cm處照明,使明暗箱區域對比明顯,避免假陽性實驗結果。(2)嚙齒類動物的焦慮情緒易受到外界環境改變的影響;應保證實驗過程中光照強度、光照位置、光照顏色保持一致。(3)明暗箱在實驗中需清潔除味,防止模型動物因嗅到特殊氣味而產生焦慮情緒。

5 討論

行為學檢測方法有助于衡量疾病的表型狀態,尤其適用于神經、精神類動物模型輔助探究疾病機制及藥物療效等。在研究過程中,選擇的行為學評價方法是否恰當、行為學實驗操作是否合理關系到研究成果的科學性、有效性和外推性。尤其是對于尚無客觀病理特征和診斷標志物的神經、精神疾病,必須由行為學評價作為其疾病表型的評估方法。

因此,行為學評價的規范化操作是保障其客觀有效的關鍵所在。由于嚙齒類動物行為學檢測受環境影響較大,如光照強度、聲音、溫度、氣味等,導致不同實驗團隊實驗結果存在差異。為使行為學結果更加準確可靠,未來行為學實驗的發展應盡可能尋求標準化和統一化,以減少各變量對實驗結果造成的影響。其次,行為學評價過程應進一步客觀化,為提高實驗結果的準確性,應更加廣泛發展計算機圖像識別技術的應用,避免實驗人員的主觀因素對實驗動物的運動表現造成錯記和漏記。此外,多種行為學評價方法聯合使用、多種行為學結果綜合分析,可一定程度上避免單一指標的局限性,更能提高不同疾病模型的行為學評價的可信性。