一種改良小鼠心臟穿刺動脈血采集方法

閆思雨 畢友坤 劉 群 姬廣聚 馬麗紅

(1.北京協和醫學院中國醫學科學院阜外醫院,北京 100037)(2.中國科學院生物物理研究所,北京 100101)

血氣分析可通過測定酸堿度(pH)和溶解在血液中的氣體(主要指CO2、O2),評價機體呼吸功能與酸堿平衡狀態。此時要求采集的血液類型為動脈血,而當其應用的對象為小鼠時,動脈血采集的操作存在一定挑戰性。目前常用的小鼠動脈血采集方式有:頸動脈采血、股動脈采血、經皮左心室穿刺采血等[1-4]。經頸動脈采集動脈血需要插管等相關器械的配合,而腹主動脈穿刺由于較大的創傷易引起機體的缺氧反應及酸堿平衡紊亂,因而小鼠動脈血采集最常使用的方式為經左心室穿刺采血。

在麻醉狀態下心臟穿刺取血是實驗室常用的小動物終末取血方法,也是美國獸醫協會批準的小型哺乳動物安樂死技術[1],尤其在需要較大血量的時候,心臟穿刺可提供穩定、大量的血液。其操作方式可由腹腔經隔膜向上刺入左心室,或由胸壁肋骨間隙刺進胸腔直入左心室,但兩者均存在難度高、成功率低的問題。該操作的順利完成需要熟練的穿刺采血技術;同時,小鼠的較小體型、毛發及皮膚的遮蓋等因素對心臟定位造成困難;而開胸直刺心臟采血則會由于機械損傷帶來的應激及反饋,造成血液成分的急劇變化,影響實驗結果。針對上述問題,我們在傳統操作方式及既往文獻報道的基礎上進行改進,建立了一種改良小鼠心臟穿刺動脈血采集方法。

1 材料與方法

1.1 材料

8周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠40只,體質量(20.38±1.34)g,健康狀況良好,由斯貝福(北京)生物技術有限公司提供,生產許可證號【SCXK(京) 2019-0010】。于中國科學院生物物理研究所SPF級動物房飼養,自由飲食,飼料為SPF級小鼠飼料,飲用滅菌水,恒溫23～25 ℃,恒濕(55±5)%,采用12 h/12 h晝夜間斷照明。實驗過程中遵照小動物福利進行,符合相關法規、標準、指南要求。

1.2 方法

1.2.1動物麻醉與固定:用 5% 戊巴比妥鈉腹腔注射進行麻醉。待小鼠被麻醉后,以皮膚捏夾及刺激腳趾反應確定小鼠進入深度麻醉狀態。將其以仰臥位置于操作板上,并用膠布固定其四肢(圖1A),使其身體保持舒展狀態,避免軀干扭曲。

注:A.小鼠四肢固定;B.傳統心臟穿刺采動脈血;C.改良后心臟穿刺采動脈血。Note: A. Mouse limbs fixed; B. Traditional heart puncture arterial blood collection; C. Improved cardiac puncture for arterial blood collection.

1.2.2心臟穿刺采血:將小鼠按體質量隨機分為傳統穿刺組和改良穿刺組,每組各20只。操作者分別采用以下兩種方法對兩組小鼠進行心臟穿刺采血。

傳統穿刺組:采用傳統心臟穿刺采血方法。一手拇指及食指分別置于小鼠兩前肢腋部,向中心輕微擠壓以固定心臟位置,另一手持肝素化(0.2 U/mL)的1 mL注射器刺入小鼠心尖搏動處,以小鼠前正中線及雙上肢連線交叉點向下向外各0.5 cm左右的位置為刺入點,與小鼠腹側皮膚呈30～40°的角度斜向上刺入,針尖指向動物頭部。當針尖出現回血后緩慢向外拉動注射器,直到采集到足夠的血液(圖1B)。在采血完成后立即以脫頸法處死小鼠。

改良穿刺組:采用改良心臟穿刺采血方法。以一手持眼科鑷夾起劍突部位的表皮,另一手持眼科剪由劍突向上呈V字形剪開小鼠皮膚,將表皮層與肌肉層分離,以止血鉗夾取剪開的小鼠表皮邊緣,置于小鼠頭部上方,暴露小鼠胸腔的肌肉層(圖1C)。此時可在小鼠第3～4肋間觀察到明顯的心臟搏動,一手持肝素化(0.2 U/mL)的1 mL注射器,從左側肋間直刺左心室,由心尖搏動點斜向上刺入,針尖朝向小鼠頭部,見到針頭隨心臟搏動且有回血則表示針尖已刺入心臟,血液借助心臟搏動力量涌入針管,操作者同時緩慢向外拉動注射器直到采集到足夠的血液,采血后立即以脫頸法處死小鼠。

1.2.3血氣分析:血氣分析的最低檢測血量要求約為0.2 mL[5]。因此,將采血成功定義為順利刺入小鼠心臟且采集到0.2 mL動脈血。為確定改良后的采血方式是否影響血氣分析檢測結果,我們使用血氣分析儀(雅培血氣分析儀i-STAT 300-G)對兩種方式得到的小鼠動脈血進行血氣分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 小鼠采血成功率、最大采血量比較

傳統穿刺組小鼠的心臟穿刺成功率為40%,最大采血量為(0.41±0.13)mL;改良穿刺組小鼠的穿刺成功率為90%,最大采血量為(0.51±0.10)mL。結果顯示,改良方法的成功率及最大采血量均顯著高于傳統方法,差異具有統計學意義(P<0.01;P<0.05),見表1。

表1 小鼠兩種心臟穿刺方法的動脈血采集情況比較Table 1 Comparison of arterial blood collection between two cardiac puncture methods in

2.2 血氣分析

傳統方法組的酸堿度pH為7.08±0.12,改良方法組的pH為7.09±0.13(t=-0.17,P=0.87);傳統方法組的二氧化碳分壓(PCO2)為35.60±6.02,改良方法組的PCO2為32.33±4.09(t=1.27,P=0.22);傳統方法組的氧分壓(PO2)為90.13±10.23,改良方法組的PO2為97.13±14.76(t=-1.10,P=0.29);傳統方法組的血氧飽和度(SO2)為87.00±5.29,改良方法組的SO2為91.63±4.41(t=-1.90,P=0.78),以上血氣分析結果均未顯示出統計學差異,見表2。

表2 小鼠兩種心臟穿刺方法的血氣分析結果比較Table 2 Comparison of blood gas analysis results of two cardiac puncture methods in

3 討論

傳統的小鼠心臟穿刺采血方法,不論采用由腹腔經隔膜向上刺入心臟或是由胸壁肋骨間隙進入胸腔直刺心臟,均很難準確地一針刺入心室腔內吸取足夠血量;而開胸后直刺心臟采血又會由于機械創傷引起血液成分改變。在本實驗中,我們對傳統的心臟穿刺方法進行了改良,只剪開小鼠表皮而不開胸,在避免對小鼠造成較大損傷的前提下,減少了皮毛滑動及影響視野的問題,增強了小鼠心臟定位的準確性,提高了穿刺的成功率及采血量。因小鼠體型和體質量對采血的成功率和最大采血量影響較大,本研究對兩組小鼠的體質量進行了統計分析,排除了這一混雜因素對操作評判的影響。同時,我們對傳統心臟穿刺和改良后心臟穿刺采集到的動脈血分別進行了血氣分析,兩組間的檢測結果并無顯著差異,且與既往研究的心臟穿刺動脈血氣分析數值相近[5]。值得注意的是,改良后采血方式檢測出的血氧飽和度在一定程度上呈現出高于傳統采血方式的趨勢,雖然未有顯著的統計學差異,但改良后的采血方式可能通過對小鼠左心的準確定位而避免右心血液的混入,從而提高動脈血的純度。

一項研究[5]對小鼠動脈血常用的幾種采集方法(頸總動脈插管、腹主動脈穿刺、經皮左心室穿刺)進行了比較,結果顯示,腹主動脈穿刺最易引起機體的缺氧反應及酸堿平衡紊亂,可能由于較大的創傷易使機體處于應激狀態,從而發生電解質、能量代謝、內環境的平衡失調。頸總動脈插管及經皮左心室穿刺相對來說更為穩定,但經皮左心室穿刺的成功率較低,且采集時可能混入靜脈血,導致血氧飽和度低于頸總動脈插管。該研究心臟穿刺存在以上問題的主要原因在于隔著皮毛對小鼠進行穿刺操作較難,同時,該研究采用的進針角度是垂直于胸壁,此角度可能造成針頭刺入右心室,從而導致采集的動脈血中混有靜脈血。本研究則在穿刺采血前需要剪開小鼠表皮,進針方式也改為由小鼠胸壁偏左側斜向上進針,這就規避了以上問題,大大提高了心臟穿刺采血的成功率,降低了混入靜脈血的可能性?？紤]到小鼠心臟穿刺采血的操作具有一定難度,多項研究嘗試對此進行改進。一項研究[6]通過向小鼠左心室注射肝素達到全身肝素化的效果,繼而開胸經右心室取血,此方式避免了開胸對小鼠血液造成高凝狀態的影響,同時也增加了采血量。但這一方式只能適用于對血液類型沒有明確要求的情況,如果實驗明確需要采集動脈血則不能使用。另一項研究[7]在超聲引導下進行小鼠心臟穿刺,可提高心臟定位的準確性和最大采血量(1.3～1.6 mL),但這一操作方式不但要求有小動物超聲的設備,也要求操作者需要熟練掌握小鼠超聲顯影,以暴露心室腔切面,方便穿刺的順利進行,做到超聲引導和針頭穿刺的良好配合。因此,這一方式雖然有利于操作精準性的提高,但其可行性和實操性依然存在一定困難。本研究對于小鼠心臟穿刺采血技術的改良主要是通過避免小鼠表皮對于操作的影響,從而達到提高穿刺準確性的目的,降低了實驗操作人員在心臟穿刺上的技術難度,且不需要特殊的儀器設備支持,易于掌握。

改良后的小鼠心臟穿刺采血技術具有定位準確、操作簡單、采血量多的優勢。但在實際操作中仍有以下幾點需要注意:(1)雖然剪開表皮后小鼠心臟定位較明確,但仍然可能出現難以抽出血液的情況,此時主要考慮刺入心臟的角度和深度問題,可能由于針頭刺到小鼠心室壁或刺穿心臟導致無法吸出血液。因此,首先需要做的是調整針刺角度,而非將針頭完全拔出。反復對小鼠心臟進行穿刺,不但可能會引起血液由心臟溢出,快速形成凝血團塊,也可能會對小鼠胸腔造成其他未知損傷。(2)在注射器的使用方面也有兩點需要引起注意,其一是在使用前需要對其進行肝素化的預處理,即使不對小鼠進行開胸處理,抽血時血液接觸抽血器具內面,也會在一定程度上激活凝血系統[6,8];其二是在抽血過程中應注意控制速度,當觀察到血液隨小鼠心跳進入注射器后,保持緩慢勻速地抽取血液。因為快速抽吸容易導致紅細胞在注射器針管內過度擠壓,引起細胞破裂,進而出現溶血現象。(3)如果需要采集的血液類型為動脈血,則需要注意進針位置應在小鼠胸壁偏左側,斜向上刺入,針尖朝向小鼠頭部。相比于傳統的由胸壁上方直刺或是由隔膜向上直刺,此種進針方向更能保證針間刺入左心室,采集到動脈血液。