單籠飼養聯合卵清蛋白制備幼齡SD大鼠支氣管哮喘伴抑郁模型*

李成堯 楊景龍 王雪旦 史瑞明

(1.西安交通大學第二附屬醫院小兒內科,西安 710004)(2.西安交通大學第一附屬醫院兒科,西安 710061)

支氣管哮喘(bronchial asthma,BA)是兒童最常見的慢性呼吸道疾病之一。根據流行病學統計數據,我國城市兒童支氣管哮喘發病率逐年上升[1]。支氣管哮喘尚無有效的根治手段,主要是基于癥狀控制的管理模式,即遵循早開始、長期、規范、個體化原則,以控制急性發作、降低危險度分級及改善預后為主要治療目標。

隨著全球哮喘防治創議(Global Initiative for Asthma,GINA)在國內的推廣及國家對公共衛生防治工作的投入,我國哮喘患者的總體控制水平較前已有明顯提高[2],但仍低于發達國家。兒童支氣管哮喘由于診斷困難、治療依從性低及身處特殊生長發育時期等原因,目前我國兒童哮喘患者的總體控制水平尚不理想[3]。相關研究發現哮喘患者的呼吸道癥狀,如咳嗽、喘息、胸悶和呼吸困難等與精神心理狀態密切相關,精神心理壓力等因素可顯著增加哮喘患者罹患抑郁癥的風險,而抑郁等精神心理障礙又常導致反復的哮喘發作、ACT評分降低等,形成惡性循環,嚴重影響哮喘總體控制水平[4]。

兒童作為特殊群體,因其抑郁篩查、診斷及治療的局限性,同時相關的臨床實驗存在倫理風險,故國內外關于兒童支氣管哮喘合并抑郁障礙的相關研究報道較少。為研究兩種疾病之間的發生、發展及轉歸關系等,本課題組選用幼齡SD大鼠制備支氣管哮喘伴抑郁樣行為動物模型,旨在為兩者之間的探索和研究提供了一個客觀、可靠、有效的手段。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:3周齡清潔級雄性SD大鼠32只,體質量(60±10)g,購于西安交通大學實驗動物中心,實驗動物生產許可證號【SCXK(陜)2023-002】,飼養于西安交通大學基礎機能實驗室動物房,實驗動物使用許可證號【SYXK(陜)2023-004】,所有大鼠均適應性飼養5 d后隨機分為群養對照組、孤養對照組、群養哮喘組、孤養哮喘組,每組8只,實驗室環境:室溫(23±2)℃,濕度恒定,持續通風,環境安靜,采用12 h/12 h晝夜間斷照明(7∶00—19∶00),標準飼料,消毒條件等同。每日早晚各觀察大鼠1次(各項體征),每周稱重大鼠1次并記錄,群養對照組8只鼠群飼養于1籠(930 mm×620 mm×250 mm),孤養組均為單飼養(320 mm×180 mm×150 mm),各籠間隔10 cm,大小鼠籠間隔擺放,鼠籠以1次/周頻次進行換籠,木屑墊料以2 天/次頻次更換。

1.1.2實驗藥品及儀器:卵清蛋白(ovalbumin,OVA)及氫氧化鋁(Sigma公司),IL-4、BDNF Elisa試劑盒(上海酶聯生物),余試劑(均西安交通大學實驗試劑中心),超聲霧化泵(江蘇魚躍)。

1.2 方法

1.2.1模型制備:大鼠從3周齡開始進行為期4 d的適應性飼養,將初次糖水偏好實驗結束記實驗開始,在實驗開始后第1,7,14天分別向群養對照組、孤養對照組的每只大鼠腹腔內注射1 mL 1×PBS緩沖液,群養哮喘組、孤養哮喘組的每只大鼠腹腔內注射1 mL OVA致敏液(每1 mL溶液含OVA 0.1 mg,氫氧化鋁 50 mg),第15至21天分別對群養對照組、孤養對照組予80 mL 0.9%氯化鈉溶液霧化熏蒸30 min,群養哮喘組、孤養哮喘組的大鼠給予80 mL OVA激發液(每1 mL溶液內含1 mg卵清蛋白)霧化熏蒸30 min,實驗第22、23、24天行末次糖水偏好實驗,實驗第25、26天行強迫游泳實驗,實驗第27天早上8∶00分別給予80 mL 0.9%氯化鈉溶液及80 mL OVA激發液霧化熏蒸30 min后安樂死,實驗全程共27 d,實驗安樂死時所有大鼠的鼠齡均為55日齡。

1.2.2糖水偏好實驗:各組動物均于模型制備前后進行該實驗,在第1天內,對所有大鼠均1鼠1籠飼養行適應性訓練,每籠均置入兩瓶濃度為1%的蔗糖水溶液,第2天分為兩部分,前12 h將其中的一瓶蔗糖水溶液換成純水,之后的12 h將蔗糖水溶液瓶及純水瓶的位置進行交換,適應結束后,禁食禁水24 h,之后12 h同時給予大鼠事前稱量好的糖水及純水(為避免水瓶位置干擾,各組標記為單號大鼠的鼠籠中左側為糖水,右側為純水,各組標記為雙號大鼠的鼠籠中左側為純水,右側為糖水),測試過程全程禁食,實驗結束后分別對各籠中蔗糖水溶液瓶及純水瓶進行稱重,記錄各液體消耗,并計算糖水偏好指數。SPI=糖水消耗量(g)/【糖水消耗量(g)+純水消耗量(g)】×100%。

1.2.3強迫游泳實驗:各組動物于末次糖水消耗實驗后的第2天進行實驗,第1個24 h對大鼠行適應性訓練,置于40 cm(水深:20 cm,水溫:24±1 ℃)透明塑料水桶中,行適應性游泳訓練15 min,結束后室溫烘干、歸籠,第2天在同等條件下進行強迫游泳6 min,雙盲記錄每只大鼠在后5 min內出現“行為絕望”表現的時間(以雙后肢是否出現活動為標準),取均值。

1.2.4血細胞分類及計數:末次霧化激發后,腹主動脈取血5 mL注入預先標記的 EDTA管中,常溫下送至西安交通大學第一附屬醫院檢驗科行血常規五分類分析。

1.2.5血清中IL-4及BDNF測定:末次霧化激發后,腹主動脈取血5 mL注入預先標記的促凝管中,低溫高速離心機2500 r/min離心20 min后取上層血清,ELISA法測定血清中IL-4及BDNF水平。

1.2.6肺組織HE染色:大鼠處死后,取右肺組織于4%多聚甲醛進行固定,常規石蠟包埋切片,HE染色后于光鏡下觀察肺組織變化。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 體征變化情況

在致敏階段各組大鼠精神狀態佳,體型肥碩,呼吸正常,毛色鮮亮,僅孤養對照組及孤養哮喘組表現輕度活動量減少;在激發階段,兩對照組僅在激發初始階段表現輕度煩躁不安,不停走動,余未出現異常行為。群養哮喘組則表現明顯煩躁不安,出現互相撕咬、抓耳撓鼻、呼吸急促、點頭呼吸等表現,歸籠后出現膽小易驚等表現。孤養哮喘組則出現活動減少,呼吸節律不齊,口周輕度發紺,歸籠后出現精神萎靡、活動減少、進食水減少等表現。激發結束后群養哮喘組及孤養哮喘組均出現毛色暗淡、活動減少等表現。

2.2 體質量變化情況

適應性飼養后各組大鼠體質量比較,差異無統計學意義(P>0.05);在哮喘大鼠模型的致敏過程(0～2周)中,各組體質量折線基本擬合,在激發過程(3周)中,兩對照組體質量曲線未見明顯差異(P>0.05),而群養哮喘組和孤養哮喘組體質量曲線均顯著低于兩對照組(P<0.05),孤養哮喘組體質量曲線顯著低于群養哮喘組(P<0.05),見圖1。

注:與兩對照組比較,aP<0.05;與群養哮喘組比較,bP<0.05。Note:Comparison with the two control groups, aP <0.05;Comparison with the group asthma group, bP <0.05.

2.3 血細胞分類及計數

群養哮喘組及孤養哮喘組靜脈血中白細胞計數高于兩對照組(P<0.05),分類中主要以淋巴細胞為主,淋巴細胞計數明顯高于兩對照組(P<0.05),其中孤養哮喘組嗜酸粒細胞計數高于兩對照組,群養哮喘組嗜酸粒細胞計數高于孤養哮喘組及兩對照組,但差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 各組大鼠血細胞分類及計數Table 1 Classification and counting of

2.4 血清中IL-4及BDNF水平

群養哮喘組及孤養哮喘組血清中IL-4水平明顯高于兩對照組(P<0.05),孤養哮喘組血清中IL-4水平較群養哮喘組稍增高(P<0.05);兩對照組血清中BDNF水平未見明顯差異,群養哮喘組血清中BDNF水平低于兩對照組,但差異無統計學意義(P>0.05),孤養哮喘組血清中BDNF水平明顯低于兩對照組(P<0.05),孤養哮喘組血清中BDNF水平低于群養哮喘組(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠血清中IL-4及BDNF水平Table 2 Levels of IL-4 and BDNF in

2.5 肺組織病理

群養對照組及孤養對照組大鼠支氣管管壁形態規則,管腔光滑無閉塞,肺泡壁清晰完整,間隔形態正常,周圍未見炎性細胞浸潤;群養哮喘組及孤養哮喘組大鼠肺組織出現明顯炎癥,支氣管管壁及周圍組織可見大量炎性細胞浸潤,肺泡壁炎性細胞浸潤、肺泡內見滲出物,部分肺泡呈擴張狀態(圖2)。

圖2 大鼠肺組織HE染色(×200)Fig.2 HE staining of rats lung tissue(×200)

2.6 糖水偏好實驗

各組大鼠在初次糖水偏好實驗中測得糖水偏好指數【糖水偏好指數(%)=糖水消耗量(g)/(糖水消耗量(g)+純水消耗量(g)×100%】未見差異;末次糖水消耗實驗中,孤養哮喘組較群養哮喘組及兩對照組糖水偏好指數明顯降低(P<0.05),在各組大鼠初末兩次糖水消耗實驗所測得糖水偏好指數對比中,兩對照組及群養哮喘組的末次糖水偏好指數均較初次糖水偏好指數明顯提高(P<0.05),孤養哮喘組的末次糖水偏好指數較初次糖水偏好指數降低(P<0.05)(表3)。

表3 各組大鼠糖水偏好指數Table 3 Sugar water preference index of

2.7 強迫游泳實驗

在6 min強迫游泳實驗中,群養哮喘組(32.64±9.09)較兩對照組(31.77±8.36)(30.63±9.24)靜止不動時間稍長,但差異無統計學意義(P>0.05)。孤養哮喘組(64.42±16.04)較群養哮喘組及兩對照組靜止不動時間長(P<0.05)。

3 討論

支氣管哮喘動物模型的制備常選用嚙齒類動物,制備方法多為生物制品進行致敏激發,有研究應用OVA加氫氧化鋁腹腔注射聯合OVA溶液激發制備支氣管哮喘大鼠模型[5];有研究采用RSV成功誘導出感染性哮喘小鼠模型[6];有研究采用屋塵螨滴劑成功制備支氣管哮喘小鼠模型[7]。抑郁動物模型的建立因研究方向的不同其抑郁模型制備的方法也各有不同,有研究采用輕度不可逃避電刺激誘導大鼠獲得性無助模型[8];采用不可預知的溫和刺激來刺激大鼠產生抑郁[9];選用基因編輯技術構建Tph1/Tph2轉基因鼠,通過降低大鼠體內色氨酸羥化酶的數量及活性來降低大鼠腦內5-HT水平,使其產生抑郁表現[10]。

傳統復合動物模型的制備方法多為誘導動物單一疾病發病,在其基礎上誘導產生另一種疾病,如有研究選用OVA對大鼠致敏激發后再通過輕度不可預見性應激來構建哮喘伴抑郁大鼠模型[11],盡管通過該方法制備的動物模型具有顯著的抑郁特征,但應用于兒童哮喘伴抑郁的研究中仍存在諸多局限。與成年哮喘患者相比,兒童哮喘患者少有復合應激刺激的持續存在,更多的是由于哮喘發生、發展的過程出現的情緒低落,亦或是反復發作所導致的自卑、孤獨及自信缺乏等輕度抑郁癥狀。相關研究調查發現,孤獨感作為抑郁的先行因素,可穩定預測抑郁的發生[12],兒童時期隨著同伴交往的重要性日益凸顯,孤獨感也隨年齡顯著提升,盡管一定的孤獨體驗有利于兒童健全人格的發展[13],但是長期的孤獨體驗勢必會引起嚴重的自我否定,導致抑郁等情緒障礙。

為了盡可能確保動物模型符合兒童生長的特殊時期以及哮喘伴抑郁在發生、發展的時空一致性上,本研究中實驗動物選用了3周齡雄性SD大鼠,在實驗過程中同時誘發哮喘和抑郁發病,且在實驗結束時所有大鼠均未達性成熟及社會性成熟的鼠齡低限[14-15],確保了模型能更好的反映兒童哮喘伴抑郁群體的病理、生理及免疫等特點。在哮喘模型制備方面,本研究主要參考Marta等所用的方法同時加以改進制備幼齡大鼠哮喘模型[16]。同時通過將屬群居動物的SD大鼠通過單籠飼養來誘發其抑郁樣行為,旨在模擬哮喘兒童在發病過程中常因請假就醫導致缺席集體活動,或因懼怕哮喘急性發作而產生社交回避等行為。

實驗結果顯示,在激發階段與兩對照組相比,所有經過OVA生理鹽水霧化激發的大鼠均出現了典型的哮喘癥狀,同時肺組織也出現了哮喘樣氣道損傷,全血細胞中白細胞總數、淋巴細胞計數及嗜酸粒細胞計數均增高,血清中IL-4含量升高等均符合典型支氣管哮喘表現。抑郁模型的評價則選用大鼠癥狀、體質量、BDNF及行為學實驗進行評估。糖水偏好實驗是以實驗動物對蔗糖水甜味的偏好來評價是否出現“快感缺失”,強迫游泳實驗則是評價動物“行為絕望”的經典方法。在本次實驗過程中,各組大鼠的初末次糖水攝取指數對比均明顯升高,表明隨著鼠齡的增長,大鼠對甜味的喜好逐漸增加,這一現象也基本符合在嬰幼兒成長過程中隨年齡增加對愉悅事物的興趣度增加。

末次糖水偏好實驗中僅孤籠哮喘組的大鼠出現糖水偏好指數降低,且強迫游泳實驗中靜止不動時間延長等均表明僅單籠飼養和僅OVA致敏激發不會導致大鼠出現抑郁樣行為。在兩對照組中,只改變鼠籠飼養條件,單籠飼養的大鼠僅出現輕度活動減少,而糖水偏好指數及強迫游泳實驗中靜止不動時間結果均無差異,說明鼠籠的選擇作為單因素變量時并不會使大鼠出現抑郁樣行為。從以上現象中不難推測對于兒童哮喘患者來說,或許孤獨感的長期持續存在會導致患兒出現抑郁表現,但在軀體健康的情況下,短期的孤獨感并不會影響其心理健康。而在兩種負面因素的同時干預下,孤養哮喘組出現典型哮喘及抑郁樣行為,也說明通過OVA來制備哮喘模型的過程中,同時施加孤獨這一負面因素可使該動物模型達到預期要求。

本研究在鼠齡選擇、制備方法等方面對以往哮喘伴抑郁共病模型的制備方法進行了改良,使其盡可能的模擬和還原兒童哮喘患者在哮喘的發生和發展過程中所出現的情形,同時制備方法可靠,且各項實驗結果便于觀察和分析,故能更好的適用于兒童支氣管哮喘伴抑郁的相關問題研究,期望該模型能為以后進一步開展兒童哮喘伴抑郁的研究提供借鑒與幫助。